一氧化氮對擬南芥氣孔運動的影響

張媛華 劉凱華

摘要：利用外源一氧化氮供體硝普鈉（sodium nitroprusside，SNP）處理、表皮條檢測的方法研究了外源NO（nitric oxide）對擬南芥（Arabidopsis thaliana）氣孔運動的影響。結果表明，隨著外源NO濃度的增大，氣孔關閉的效應也逐漸增大。但該效應可被c-PTIO逆轉。此外，就內源NO在光、暗調控的氣孔運動中的作用進行了討論。

關鍵詞：一氧化氮；擬南芥（Arabidopsis thaliana）；氣孔運動

中圖分類號：Q945 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）04-0835-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.04.006

Effects of Nitric Oxide on Stomatal Movement in Arabidopsis thaliana

ZHANG Yuan-hua，LIU Kai-hua

（College of Chemistry and Life Science， Weinan Normal University， Weinan 714099，Shaanxi，China）

Abstract： This article focused on the effect of nitric oxide on dark regulated stomatal movement in Arabidopsis thaliana， with the method of chemical trement by the exogenous donor of nitric oxide， sodium nitroprusside（SNP）， and determination of the stomatal aperture of the epidermal stripes in Arabidopsis. The results showed that the stomatal was closed with increasing concentration of exogenous NO in light. Conversely， it has no effect on stripes in darkness with the same treatment. But the darkness regulated stomatal closure can be reversed by c-PTIO and L-NAME. It indicated that NO could be activated by darkness and this high level of NO was responsible for the stomatal closure of Arabidopsis.

Key words： nitric oxide； Arabidopsis thaliana； stomatal movement

氣孔是植物體與外界環境進行CO2、O2和水蒸氣等氣體交換的重要器官，許多生物和非生物因素都可以影響氣孔運動[1]。一氧化氮（NO，nitric oxide）是一種廣泛存在于植物體內且具有水溶性和脂溶性及自由基性質的氣體活性分子。作為新型的信號分子，NO參與調節植物多種生理過程，如根的生長發育[2]、光形態建成[3]、種子萌發[4]、各種脅迫反應及抗病防御反應[5]、氣孔運動[6]、細胞程序性死亡[7]、果實等組織的成熟及衰老[8]等。Neill等[9]報道NO是ABA誘導氣孔關閉信號途徑中的一個信號分子。NO的合成是ABA誘導氣孔關閉所必需的，ABA增強了保衛細胞NO的合成，外源NO也可以促進氣孔關閉，ABA以及NO對氣孔關閉的誘導作用需要cGMP以及cADPR的合成與參與[10]。此外，大量證據表明，NO參與暗反應[11]及UV-B[12]、水楊酸[13]、茉莉酸[14]、細胞分裂素和生長素等物質合成，均能誘導氣孔關閉[15]。然而，關于NO與光/暗誘導氣孔運動的關系相對較少。因此，本研究以擬南芥葉片下表皮為材料，通過觀察外源NO供體硝普鈉（sodium nitroprusside， SNP）對氣孔運動的影響，初步探索NO在光/暗調控氣孔運動中的可能作用，以期為進一步探索保衛細胞信號轉導途徑積累資料。

1 材料與方法

1.1 材料

選取大小一致、子粒飽滿的擬南芥（Arabidopsis thaliana）種子，均勻播種于營養缽中，每缽2～3株，然后在人工氣候箱中培養，光/暗周期為14 h/10 h，光周期的光照強度為300 μmol/（m2·s），溫度為25 ℃/18 ℃，相對濕度75%。幼苗生長期間每天澆水1次，無任何水分脅迫。待幼苗長至4～6周齡時取上部完全展開、光照充分的葉片作為試驗材料。

1.2 試劑

SNP（sodium nitroprusside，NO供體），L-NAME（NG-nitro-L-arginine methyl ester， 動物NOS抑制劑），c-PTIO（carboxy-2-phenyl-4，4，5，5-tetramethylimidazoline，NO特異的清除劑），MES[2-（N- morpholino） ethanesulfonic acid，2-（N-嗎啡琳）乙烷磺酸]均購自Sigma公司，DMSO（Dimethyl sulfoxide，二甲基亞砜）購自Amresco公司，其他均為國產分析純試劑。

1.3 氣孔開度的測定

取4～6周齡擬南芥幼苗頂部生長良好、完全伸展、光照充分的葉片，用鑷子撕取其下表皮，再用毛刷除去下表皮上黏附的葉肉細胞，然后將其置于MES-KCl緩沖液（MES 10 mmol/L， KCl 50 mmol/L， pH 6.15）中，制成適度大小的表皮條。然后將新鮮表皮條置于25 ℃、相對濕度80%的培養箱中進行各項處理。光處理光照強度300 mol/（m2·s），于限度時間在顯微鏡（Nikon TE 300）下用測微尺測量氣孔孔徑，測量時每次隨機選取4個視野，每個視野隨機選取5個氣孔，每處理均重復3次以上。

所得數據計算平均值和標準誤差并用one-way AVOVA分析（Duncan分析，α=0.05水平）。

2 結果與分析

2.1 不同濃度SNP對光下氣孔開度的影響

由圖1可知，所示濃度NO均表現出促進氣孔關閉的效應，且隨濃度的增加促進效應逐漸增大。10 μmol/L的NO促進效應最小，100 μmol/L的NO可以使氣孔開度減小54.92%，而1 000 μmol/L的NO雖然能有效促進氣孔關閉（與對照相比，氣孔孔徑減小了60.68%），但已使葉片細胞受到了一定程度的傷害。因此在后續試驗選擇SNP 100 μmol/L為最適濃度。

2.2 不同濃度SNP對暗處理中氣孔開度的影響

由圖2可知，暗處理能誘導氣孔關閉，但濃度遞增的SNP處理后表皮條的開度并未發生明顯變化。結果表明，SNP對暗誘導的氣孔運動沒有影響，或作用很小。

2.3 c-PTIO和L-NAME對光下SNP誘導氣孔運動的影響

為了進一步研究光下SNP誘導氣孔關閉的機制，利用L-NAME和c-PTIO分別與SNP共處理的方法探究NO是否參與誘導光下氣孔關閉。L-NAME是NOS合成抑制劑，能夠有效抑制植物體內NO的生物合成；c-PTIO為NO清除劑，能夠清除植物體內生成的NO。試驗中采用的L-NAME和c-PTIO的濃度均為100 μmol/L。由圖3可見，100 μmol/L的c-PTIO能有效抑制光下SNP誘導的氣孔關閉（P<0.05），但100 μmol/L的L-NAME卻不能抑制SNP誘導的氣孔關閉。結果表明，光下氣孔開放可能與表皮條內較低的NO水平有關，較高濃度的NO能夠誘導氣孔關閉。

2.4 c-PTIO和L-NAME對暗誘導氣孔關閉的影響

為了探明暗處理與NO水平的關系，用c-PTIO和L-NAME對暗環境中的表皮條進行處理，結果如圖4所示。由圖4可知，暗誘導擬南芥離體表皮條氣孔關閉，但經NOS抑制劑L-NAME與c-PTIO處理后，表皮條的氣孔開度分別增大了52.7%和60.1%，差異顯著（P<0.05）。結果表明，暗環境中表皮條內的NO水平相對光下較高，暗環境能夠誘導氣孔保衛細胞產生NO，而產生的NO積累后可能進一步誘導氣孔關閉。但是，通過NOS合成NO的途徑可被其合成抑制劑所阻斷，因此，暗處理中用L-NAME處理的表皮條氣孔并未關閉，即阻斷暗誘導的氣孔關閉。對于通過其他途徑已經產生或正在產生的NO，經c-PTIO的清除作用處理后，同樣能夠阻止暗誘導氣孔關閉。

3 小結

前人的研究表明，NO能夠作為植物體內重要的信號分子，參與調節植物體的生長發育、防御反應、基因表達和細胞凋亡等生理過程[16]，也有研究發現NO介導脫落酸（ABA）[9]和水楊酸（SA）[13]促進氣孔關閉的效應。通過對擬南芥表皮條的研究發現，外源NO能明顯促進葉片下表皮氣孔關閉，這與彭俊玲等[17]的觀點一致。然而，暗能誘導氣孔關閉，但外源NO對暗處理下的表皮條氣孔開度沒有影響。因此，為了探明NO在植物氣孔運動中的作用，又利用NOS的合成抑制劑L-NAME和NO清除劑c-PTIO對光下擬南芥葉片下表皮進行處理，結果表明，內源合成的NO能夠誘導氣孔關閉，該結果與李建華等[18]的研究結果一致。同樣，為了進一步證實NO能夠誘導氣孔關閉的結論，通過暗處理中加入合成抑制劑L-NAME和NO清除劑c-PTIO的方式進行了驗證。結果表明，L-NAME和c-PTIO能顯著抑制暗處理中氣孔的關閉。由研究結論推斷，暗處理能誘導內源NO的產生，并且NO作為重要的信號分子參與光/暗調控的氣孔運動，暗誘導的氣孔關閉是通過下游NO信號分子的參與實現的，與穆娟等[19]的研究結果一致。

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