百草枯對人肝HepG2細胞的致突變性

唐超智 張玉玲 王文晟

摘要：采用微核（MN）試驗和姊妹染色單體交換（SCE）試驗評價了百草枯（Paraquat，PQ）對人肝HepG2細胞的致突變性。結果顯示，7.21 mg/L的PQ處理即可導致HepG2細胞的MN率和SCE頻率均明顯升高，且MN率和SCE頻率升高趨勢均與PQ處理濃度呈正相關，至34.57 mg/L的PQ處理組，HepG2細胞的MN率和SCE頻率分別升高為正常組的5.29和6.07倍，表明PQ對人肝HepG2細胞具有明顯的致突變性。

關鍵詞： 百草枯； HepG2細胞； 微核； 姊妹染色單體交換； 致突變性

中圖分類號：Q813.5 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）04-0896-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.04.020

The Mutagenicity of Paraquat on HepG2 Cell

TANG Chao-zhi， ZHANG Yu-ling， WANG Wen-sheng

（College of Life Science，Henan Normal University，Xinxiang 453007，Henan，China）

Abstract： The mutagenecity of paraquat （PQ） on human liver HepG2 cells by micronucleus （MN） and sister chromatid exchange （SCE） assay were evaluated. The experimental results showed that MN ratio and SCE frequency of HepG2 cells increased after the treatment of 7.21 mg/L PQ. And there was a positive correlation between the dose of PQ and the change of MN ratio and SCE frequency. When it came to the treatment group of 34.57 mg/L PQ， MN ratio and SCE frequency of HepG2 cells rised respectively up to 5.29 and 6.07 times of the normal group. The results indicated that PQ had evident mutagenicity on human liver HepG2 cells.

Key words： paraquat； HepG2 cell； micronucleus； sister chromatid exchange； mutagenicity1

百草枯（Paraquat，PQ）是世界上使用量最大的除草劑之一，因其易于被土壤吸附、在環境中殘留量低和具有良好的除草效果，PQ一直深受農牧業區人民的歡迎[1]。但PQ自使用以來，已經引起了嚴重的公共健康問題，由PQ導致的自殺、謀殺、誤服以及生產和使用接觸的死亡事件屢見不鮮[2-4]。PQ的毒性研究已在肺[5-8]、腎[9，10]和神經組織[11，12]被廣泛探討，但PQ的毒性機制仍未完全闡明，部分學者認為PQ可能首先使細胞發生氧化損傷[5，11，13]，進而引起細胞凋亡[13-15]，最終導致炎癥暴發[8，11，16]、組織壞死。目前人們對PQ中毒仍無良好的治療策略和高效的解毒劑。近年來，Shukla等[17]發現PQ會引發果蠅基因突變導致的毒性效應，該研究拉開了PQ中毒基因療法的序幕，為PQ中毒的治療提供了一個新的突破口，但同時也引起了人們對PQ遺傳毒性的關注。之前關于PQ遺傳毒性的試驗主要集中于嚙齒類，至今尚無PQ對人細胞遺傳毒性的報道。為此，本研究采用微核（Micronucleus，MN）試驗和姊妹染色單體交換（Sister chromatid exchange，SCE）試驗評價了PQ對人肝HepG2細胞的致突變性。

1 材料與方法

1.1 材料

所用人肝HepG2細胞株由鄭州大學第五附屬醫院提供，源自中國科學院上海細胞庫（目錄號為TCHu 72）。分析純PQ購自上海譜振生物科技有限公司（1910-42-5），帶回實驗室以去離子水（Deionized water，DW）溶解備用。胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS）購自杭州四季青公司（2104）、DMEM（dulbecco′s modified eagle medium）培養液購自美國Hyclone公司（30022.01B）、常規培養細胞以90% DMEM+10% FBS作為完全培養液、0.25%胰酶購自美國Life Technologies公司（1427015）、Giemsas染料購自上海科興商貿有限公司（S0006）。在實驗室準備66 mL甘油，先將Giemsas染料放入研缽中加入少量甘油研磨至無顆粒，然后倒入其余甘油，56 ℃孵育2 h，再加入66 mL甲醇，即成Giemsas染液母液。Giemsas染液母液保存于棕色瓶內，臨用時以pH 6.8的PBS稀釋10倍即為Giemsas染液工作液。BrdU購自武漢博士德生物工程有限公司（ED1100）。秋水仙素溶液購自北京天恩澤生物技術有限公司（100301-1）。20×SSC緩沖液配方為：以DW溶解3 mol/L NaCl、0.3 mol/L檸檬酸鈉后，濃HCl調節pH至7.0。其他常規化學試劑均由河南師范大學生命科學學院實驗辦公室提供，分析純以上等級。

1.2 方法

1.2.1 HepG2細胞的培養和傳代 人肝HepG2細胞用無菌PBS洗滌3次（3 mL/次， 下同），加入新鮮的DMEM完全培養液6 mL，置于5% CO2、37 ℃培養箱內培養，箱底層存300 mL無菌DW保持箱內濕度。6 h后進行細胞傳代，其操作如下。

①從CO2培養箱內取出培養板，PBS洗3次。②2 mL胰酶37 ℃消化5 min，以4 mL PBS終止。③將細胞懸液移入離心管，1 000 r/min離心5 min。④棄上清，加4 mL新鮮的DMEM完全培養液懸浮細胞。⑤將每1 mL細胞懸液移入1個單孔培養板中，各加入5 mL新鮮的DMEM完全培養液。⑥輕輕晃動培養板數次，Leica DMIL LED fluo倒置，顯微鏡下觀察HepG2細胞均勻鋪布培養板底面，作好標記后，置于CO2培養箱內培養。

1.2.2 PQ對HepG2細胞MN比率的影響 MN試驗操作如下。

①常規胰酶消化、收集經0、7.21、10.67、15.78、23.36和34.57 mg/L的PQ處理24 h的HepG2細胞，加入5 mL 0.075 mol/L KCl溶液，37 ℃水浴10 min低滲處理。②離心棄上清，加入甲醇/冰醋酸（Glacial acetic acid，GAA）（3∶1，下同）混合液5 mL輕輕混勻，25 ℃靜置10 min。③離心收集細胞，加入甲醇/GAA混合液0.5 mL輕輕混勻懸浮細胞，吸取細胞懸液涂于載玻片上，鋪開、晾干。④滴加Giemsas染液工作液2～3 滴覆蓋細胞，靜置1 min，補滴pH 6.8的PBS 4～6滴，靜置10 min，去離子水輕輕漂洗、吸水紙吸干。⑤Zeiss Axioskop 40數碼正置顯微鏡觀察和統計各試驗組HepG2細胞的MN率（每個試驗組設3個重復，每個重復3張片子，每張片子選取細胞集中區域計數3個視野的MN比率，取平均值），20×物鏡下照相（目鏡10×）。

1.2.3 PQ對HepG2細胞SCE頻率的影響 SCE試驗具體操作如下。

①常規培養的HepG2細胞以0、7.21、10.67、15.78、23.36和34.57 mg/L的PQ處理24 h，更換不含PQ、添加BrdU（終濃度為100 μg/mL）的新鮮培養液，避光培養44 h，加秋水仙素（使其含量為0.2 μg/mL），混勻繼續培養4 h。②胰酶消化、收集細胞，加入5 mL 0.075 mol/L KCl溶液，37 ℃水浴10 min低滲處理。③加1 mL甲醇/GAA混合液，用微量移液器輕輕吹吸混勻，1 000 r/min離心10 min。④棄上清，加5 mL甲醇/GAA混合液，輕輕吹吸混勻，室溫靜置15 min，1 000 r/min離心10 min。重復本步驟1次。⑤棄上清，加0.3 mL甲醇/GAA混合液，輕輕吹成細胞懸液。⑥取細胞懸液1滴，高位（40 cm）滴于-20 ℃預冷的冰浴載玻片上，立即置于酒精燈火焰上左右移動載玻片使其上的懸液受熱烤干（不宜劇烈烘烤）、貼緊，37 ℃恒溫箱內靜置48 h。⑦將上步的載玻片置于大號培養皿內，正面朝上，片上覆蓋1層擦鏡紙，從片外鏡頭紙邊沿加2×SSC緩沖液使全擦鏡紙浸濕。將培養皿移入60 ℃水浴鍋內，紫外線燈距離5 cm，照射30 min（SSC液易干，應注意補加）。取出樣品片，DW漂洗，晾干。⑧同“1.2.2”中④染色。⑨Zeiss Axioskop 40數碼正置顯微鏡下觀察和統計各試驗組HepG2細胞的SCE率（每個試驗組設3個重復，每個重復3張片子，每張片子選取30個阻斷在中期的細胞分裂相記錄SCE總次數，每個末端交換記作1次SCE，每個中部交換記作2個SCE，最終計算出各組中該30個細胞的平均SCE頻率），100倍物鏡（油鏡）下照相（目鏡10×）。

1.3 數據分析

應用SPSS 17.0軟件，以t檢驗比較各PQ處理組與正常組之間數據差異的顯著性，Excel 2007作圖。

2 結果與分析

2.1 PQ對HepG2細胞MN比率的影響

各試驗組HepG2細胞的MN現象如圖1所示。由圖1可以看出，經低滲處理后再進行Giemsas染色，所獲得的HepG2細胞的胞膜邊界不甚清晰，胞質幾乎不著色，但胞核較大、邊界清晰、著色十分明顯，且核旁邊的MN著色非常明顯，與胞質底色的差異度較高，該方法提高了MN的辨識準確率和統計速度。

統計各試驗組HepG2細胞的MN比率，并分析數據的差異性記錄見圖2。由圖2可知，PQ處理組的MN比率均明顯高于正常組，且MN比率升高趨勢與PQ處理濃度呈正相關，34.57 mg/L的PQ處理組的MN比率為正常組的5.29倍。

2.2 PQ對HepG2細胞SCE頻率的影響

各試驗組HepG2細胞的SCE現象如圖3所示。由圖3可以看出，隨著PQ處理濃度增大，HepG2細胞染色體的形態越不規律。統計各試驗組HepG2細胞的SCE頻率，并分析數據的差異性記錄見圖4。由圖4可知，PQ處理組的SCE頻率均明顯高于正常組，且SCE頻率升高趨勢與PQ處理濃度呈正相關，34.57 mg/L的PQ處理組的MN比率為正常組的6.07倍。

3 小結與討論

眾所周知，有毒物質的致突變性研究最常用的是MN試驗[18-20]，一般MN試驗統計的細胞主要是體內的血細胞，關于離體細胞MN試驗發展較晚，其操作方法與經典的血細胞染色和統計方法基本一樣，對于較小的核需要1 000×放大（油鏡）方可勉強識別，統計工作比較費力。本研究在MN試驗操作中染色前對細胞進行了低滲處理和固定，結果于200×鏡下對較小的核也可以十分清晰地觀察到，這就使MN的識別工作簡單化，統計準確率和速度得以大大提高，其對顯微鏡的潔凈保持和使用壽命也具有重要意義，因此低滲處理是開展MN試驗的一個良好的改進，值得同行借鑒。在應用MN試驗調查PQ的致突變性之前，從事G蛋白偶聯受體基因Methuselah（mth）研究的加利福尼亞大學的Lin等[21]發表了PQ長期處理引起果蠅mth突變的觀點，認為mth的突變是果蠅適應饑餓、高溫、PQ等外界氧化損傷壓力的一種適應性反應。印度學者Shukla等[17]為了闡明mth在帕金森病（Parkinsons disease， PD）等人類衰老疾病中的作用，深入探討了果蠅mth突變對PQ導致的PD表征的調節作用。盡管兩個研究組均證實了PQ具有基因誘變作用，但其僅檢測了mth基因，未針對PQ的致突變作用作普遍性調查。采用MN法評估PQ致突變性的報道僅見于Muangphra等[22]對蚯蚓的個體試驗，該研究組檢測到4和0.4倍LC50 濃度的PQ處理48 h可分別導致蚯蚓體腔細胞的MN率提高至正常組的5.86和4.14倍。本研究首次選用了人細胞，以MN試驗分析PQ的致突變性，測知最高濃度34.57 mg/L（0.67倍的LC50）的PQ處理24 h會導致HepG2細胞的MN率增至正常組的5.29倍，證明PQ對HepG2細胞也有致突變性。

致突變性的另一個檢測方法是SCE試驗，SCE試驗的原理與MN試驗不同，它是基于染色體重組層面的研究，相對于MN更為微觀[23-25]。此外，SCE的操作更為復雜，需要對試驗材料的活體作Brdu預處理，但SCE對突變的分析有其獨特的重要意義，SCE試驗調查了染色體的片段交換率，直接反映了染色體重組率，而MN的出現是DNA斷裂導致遺傳信息變化的反映[26-28]。因此，對DNA斷裂或重組導致的突變應該分別采用MN和SCE雙重檢測才能更全面地給予定論[29-31]。Nicotera等[32]應用SCE作為檢測指標探討PQ致突變性，稱中國倉鼠成纖維母細胞的SCE與PQ處理濃度呈正相關。2年之后，臺灣中央研究院的Wang等[33]以原代的大鼠氣管上皮（Rat tracheal epithelial，RTE）細胞和中國倉鼠卵巢（Chinese hamster ovary，CHO）細胞為材料調查了PQ對SCE的影響，結果表明低于LC50的PQ劑量僅導致RTE細胞的SCE上升，未明顯導致CHO細胞的SCE上升。此外，Tanaka等[34]以離體培養的中國倉鼠肺（Chinese hamster lung，CHL）細胞為材料探討了PQ的致突變性，發現PQ處理濃度越大，CHL細胞的SCE頻率越高；Tanaka[35]然后嘗試以己酮可可堿（Pentoxifyline，POF）來防治PQ引起的SCE頻率升高，結果表明POF及其甲基黃嘌呤衍生物預處理CHL細胞均可抑制超氧陰離子產生，進而減少PQ導致的高頻SCE，同時發現POF并不能完全抑制白細胞產生超氧陰離子，但可清除氧自由基的活性。Ribas等[36]以離體培養的人白細胞為材料作了一些驗證性試驗，檢測數據證實PQ對白細胞SCE頻率有輕微增高作用。Tanaka[37]發現山竹果的提取物山酮素可以有效地降低PQ導致的CHL細胞高頻SCE現象。PQ對肺致突變性的這些研究是基于早期大量的PQ肺損傷動物試驗之上的，由于PQ的肝毒性研究相對較少、起步較晚，目前仍未見PQ對肝細胞SCE頻率的檢測。本研究檢測PQ對HepG2細胞SCE頻率影響的數據顯示，7.21 mg/L的PQ處理即對HepG2細胞有明顯的SCE頻率增高效應，至34.57 mg/L的PQ處理組，HepG2細胞的SCE頻率可達正常組的6倍以上，表明PQ對HepG2細胞有明顯的致突變性。

綜上所述，PQ對人肝HepG2細胞具有較強的致突變性。正如多年以來公共環境健康研究領域的學者和專家所預測的那樣，PQ的長期使用和積累可能已為人類生命健康埋下危險的種子[2-4，16]，深入探討PQ對人細胞的毒性機理、積極尋求良好的治療方法或高效的解毒劑已刻不容緩。

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