地衣芽孢桿菌 NJWGYH 833051的抑菌作用

王春曉 胡永紅 楊文革 等

摘要：通過地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）對不同病原菌平板抑制試驗以及在植物上的定殖試驗，初步研究其抑菌作用。結果表明，地衣芽孢桿菌對番茄葉霉病菌有較好的抑制作用。

關鍵詞：地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）；平板抑制；生物防治

中圖分類號：S476+.11 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）04-0904-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.04.022

The Control Effect of Bacillus licheniformis NJWGYH 833051

WANG Chun-xiao， HU Yong-hong， YANG Wen-ge， WU Gang， GU Peng-fei， DING Zhi-wen， CHEN Zhao-guo

（State Key Laboratory of Materials-Oriented Chemical Engineering， Nanjing Tech University， Nanjing 211816， China）

Abstract： The control effect of Bacillus licheniformis was preliminary studied through B. licheniformis of different pathogens tablet inhibition experiment and its colonization in the plant. The results showed that the B. licheniformis had good inhibition to Fulvia fulva.

Key words： Bacillus licheniformis； tablet inhibition； biological control

地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）分布廣泛，空氣、土壤和其他各種環境中都有分布，其生理和生化特性也多種多樣，在其生存環境如植物微生態和土壤中是一種優勢菌種，具有廣泛的應用前景。地衣芽孢桿菌產生的多種活性物質[1-3]包括溶菌酶、細菌素、抗菌蛋白和各種抗生素[4]（包括磷脂類、氨基酸類、核酸類、脂肽類、肽類、多烯類）等，對很多病原微生物具有很好的抑制作用。化學農藥的大量使用造成了殘留物污染，對農產品產量和食品安全造成威脅[5-9]。地衣芽孢桿菌產生的抗菌物質對某些病原菌具有很好的抑制作用，可以應用在生物農藥的研究生產上[10，11]。因此，研究地衣芽孢桿菌的抑菌作用，為高效綠色生物農藥研究開發提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗菌種為地衣芽孢桿菌NJWGYH 833051，由南京工業大學材料化學與化學工程國家重點實驗室篩選保存；番茄早疫病菌、白菜黑斑病菌、辣椒疫霉病菌、番茄灰霉病菌、番茄枯萎病菌[10，11]均由江蘇省農業科學院提供。

供試植物為日本美玉番茄，由江蘇省農業科學院提供。

①平板培養基（g/L）：牛肉膏5、蛋白胨10、瓊脂20、氯化鈉5、pH 7.0～7.2、去離子水1 000 mL、121 ℃滅菌。②液體培養基（g/L）：葡萄糖15、蛋白胨10、牛肉膏5、氯化鈉5、硫酸錳1、磷酸二氫鉀2、硫酸鎂0.5、pH 7.0～7.2、去離子水1 000 mL、121 ℃滅菌。③PDA培養基（g/L）：馬鈴薯200、蔗糖20、瓊脂15～20、去離子水1 000 mL、pH 7.0、121 ℃滅菌。④LB培養基（g/L）：酵母浸膏5、蛋白胨10、NaCl 10、去離子水1 000 mL、pH 7.0、121 ℃滅菌。⑤YPGA固體培養基（g/L）：胰蛋白胨5、葡萄糖5、酵母膏5、瓊脂20、去離子水1 000 mL、pH 7.0、121 ℃滅菌。

菌體代謝液的配制：從平板接種1環菌液到裝有80 mL液體培養基的500 mL三角瓶中，按照以上最佳培養基和培養條件培養24 h，制備發酵液，濃度為108 cfu/mL。

菌懸液的配制：取部分上述發酵液， 10 000 r/min離心10 min，棄去上清液，保留菌液，經干燥測定其效價，然后用無菌水配制菌懸液，濃度為108 cfu/mL。

1.2 方法

1.2.1 對不同病原菌的平板抑制試驗

1）含地衣芽孢桿菌平板的配制。從平板接種1環菌液到裝有80 mL液體培養基的500 mL三角瓶中，按照以上最佳培養基和培養條件，培養24 h，制備發酵液，此后按一定的比例添加到冷卻至40 ℃平板的培養基中，在超凈臺上傾注平板，制成含菌體平板備用。

2）含藥及對照平板的配制。以多菌靈和腐霉利為陽性對照。以0.02 mol/L的稀鹽酸稀釋溶解多菌靈制備成母液，在LB培養基中添加合適的劑量，混合均勻，在超凈臺上傾注平板，制成含藥平板備用；以丙酮溶解稀釋腐霉利原藥制成濃度為1 000 μg/mL的母液，在培養基中添加合適的劑量，混合均勻，在LB超凈臺上傾注平板，制成含藥平板備用。

將直徑為0.5 cm病原菌的菌碟菌絲朝下，分別接種在上述3種培養皿中。置于25 ℃恒溫恒濕培養箱中培養。當空白對照菌落鋪滿平板2/3以上時，采用十字交叉法測量各平板的菌落直徑，重復3次，取平均值。根據菌落直徑確定藥劑對病原菌生長的抑制率。

病原菌生長抑制率=（空白菌落直徑-處理菌落直徑）/（空白菌落直徑-菌餅直徑）×100%

3）番茄葉片離體試驗。采摘同一株番茄上兩個葉片，放入裝有三片用無菌水浸濕濾紙的平板中，放入光照培養箱中，25 ℃，濕度70%，在兩個葉片上同時接種番茄葉霉病菌，其中一個噴灑地衣芽孢桿菌菌液，另一個則作為空白對照。

1.2.2 地衣芽孢桿菌NJWGYH 833051在植物上的定殖試驗

1）在番茄葉表的定殖試驗。溫室育苗，盆缽單株移栽，待番茄苗長到20 cm左右時，取在YPGA培養液中培養48 h的利福平標記菌株的菌液，噴霧接種于番茄葉片上，設不接菌為對照。每批處理24棵苗，罩膜保溫，光照12 h，溫度18～25 ℃。初始菌量設定為處理1 h后分離取樣菌體的數量，此后分別在1、3、5、7、11、15、21 d后取樣分離。

在噴菌的番茄植株上用無菌刀片隨機取20 cm2葉片，剪碎，用100 mL無菌水振蕩洗滌碎片30 min，隨后進行梯度稀釋，不同稀釋度洗滌液取0.1 mL進行平板涂布，PDA平板含有400 μg/mL的利福平，每個稀釋梯度涂布3塊平板，于恒溫恒濕培養箱中36 ℃下培養24 h，測定菌落數，并對其在番茄葉表的定殖數量（菌量用cfu/cm2表示）進行換算。

2）在番茄根部的定殖試驗。溫室育苗，盆缽單株移栽，待番茄苗長到20 cm左右時，取在YPGA培養液中培養48 h的利福平標記菌株的菌液，灌根接種于番茄根部，每株澆灌10 mL，設不接菌為對照。每批處理24棵苗。罩膜保溫，光照12 h，溫度18～25 ℃。

處理1 h后取樣分離作為初始菌量，分別在1、3、5、7、11、15、21 d后取樣分離1次。取樣時將苗拔出，取根部土壤5 g，采用無菌水洗滌振蕩30 min，然后進行梯度稀釋，在含利福平濃度為400 μg/mL的PDA平板中，傾注0.1 mL不同稀釋度洗滌液并進行涂布，每個稀釋梯度涂布3個平板，36 ℃下培養24 h后，測定每個平板的菌落數，并換算成在番茄根部的定殖數量（菌量用cfu/g表示）。

2 結果與分析

2.1 地衣芽孢桿菌對不同病原菌的平板抑制作用

2.1.1 對不同病原菌的平板抑制試驗 為考察地衣芽孢桿菌NJWGYH 833051的抑菌效果，以多菌靈和腐霉利作為對照，將不同病原菌進行平板抑菌試驗，具體結果見表1。由表1可知，未離心的地衣芽孢桿菌NJWGYH 833051發酵液可以有效抑制番茄葉霉病菌，當劑量為106 cfu/mL時對其的菌絲生長抑制率達87.15%，略低于多菌靈藥劑的抑菌效果；地衣芽孢桿菌NJWGYH 833051離心后對番茄灰霉病菌的抑制率為51.36%，與對照藥劑腐霉利的抑制率相當；地衣芽孢桿菌NJWGYH 833051發酵液未離心時對番茄灰霉病菌的抑制率高于對照藥劑腐霉利的抑制率，達60.23%。地衣芽孢桿菌NJWGYH 833051對部分病原菌的抑菌效果見表1、圖1、圖2。

2.1.2 番茄葉片離體試驗 以離體番茄葉片為研究對象，考察了地衣芽孢桿菌NJWGYH 833051對番茄葉霉病菌的抑菌效果，結果如圖3所示。由圖3可以看出，1號對照葉片接種番茄葉霉病菌后3 d，其接種附近葉面開始霉變，而用地衣芽孢桿菌噴灑過的2號葉片顏色依然較綠，變化不大，說明地衣芽孢桿菌NJWGYH 833051對番茄葉霉病菌有較好的抑制作用。

2.2 地衣芽孢桿菌在番茄上的定殖效果

2.2.1 地衣芽孢桿菌在番茄葉表的定殖效果 地衣芽孢桿菌NJWGYH 833051能在番茄葉面上定殖，但隨時間延長葉面上定殖的菌量會有所降低，定殖效果如圖4所示。由圖4可以看出，在0～30 d，噴灑地衣芽孢桿菌NJWGYH 833051菌株在番茄葉面定殖菌數為1.30×106～2.47×106 cfu/cm2鮮葉。地衣芽孢桿菌噴灑處理4 d后，菌株可能對環境不適應，菌數下降到1.81×106 cfu/cm2鮮葉，噴灑處理后第7天有1個菌數高峰，菌數達到2.24×106 cfu/cm2鮮葉，這可能是由于地衣芽孢桿菌繁殖能力和定殖能力很強，逐漸適應了環境，在短期內形成了種群優勢。在后期，菌數趨于平穩，可能是葉片原有微生物恢復競爭力以及環境因素導致其菌數下降，最后趨向于平衡。

2.2.2 地衣芽孢桿菌在番茄根部的定殖效果 地衣芽孢桿菌NJWGYH 833051在番茄根部定殖效果如圖5所示。由圖5可以看出，地衣芽孢桿菌NJWGYH 833051能在番茄根部很好地定殖，但隨時間延長根部定殖的菌量會有所降低。地衣芽孢桿菌在土壤中20 d內菌量由8.26×106 cfu/g下降到2.73×106 cfu/g。處理一周后，菌量下降，表明地衣芽孢桿菌生長環境改變后，產生了不適應；處理11 d后，菌量有所增加，說明地衣芽孢桿菌已經適應了新環境，在番茄根部進行了定殖。隨后菌量逐漸下降，可能因為土壤中微生物與地衣芽孢桿菌NJWGYH 833051產生競爭作用，最后菌量到達平衡，20 d后，菌量保持在2.69×106 cfu/g左右，表明地衣芽孢桿菌NJWGYH 833051可以在番茄根際生長繁殖。

3 小結與討論

本試驗考察了地衣芽孢桿菌NJWGYH 833051對番茄早疫病菌、白菜黑斑病菌、番茄葉霉病菌、番茄枯萎病菌、番茄灰霉病菌5種致病菌的抑菌效果，結果表明，未離心的地衣芽孢桿菌NJWGYH 833051發酵液可以有效抑制番茄葉霉病菌，當劑量為106 cfu/mL時對番茄葉霉病菌的菌絲生長抑制率達87.15%，抑菌效果略低于多菌靈藥劑。地衣芽孢桿菌NJWGYH 833051離心后對番茄灰霉病菌的抑制率為51.36%，與對照藥劑腐霉利的抑制率51.49%接近，地衣芽孢桿菌NJWGYH 833051發酵液未離心時對番茄灰霉病菌的抑制率高于對照藥劑腐霉利的抑制率51.49%，達到60.23%。通過地衣芽孢桿菌NJWGYH 833051在番茄葉面與根際的定殖效果試驗，表明地衣芽孢桿菌NJWGYH 833051在番茄表面和根際的定殖能力良好，為其發揮良好的生物防治作用打下了堅實的基礎。

本研究證實了地衣芽孢桿菌NJWGYH 833051具有抑菌效果，芽孢桿菌往往同時產生多種對特定病原菌具有很高活性的抑菌活性物質，從地衣芽孢桿菌中分離純化出具有活性的抑菌物質對于新型生物農藥的研制具有深遠意義。后續試驗將進一步研究地衣芽孢桿菌的抑菌機理，并將探索提取發酵液中的蛋白類抑菌活性物質的方法，對提取出的抑菌活性物質進行分離純化和鑒定。

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