雄性不育濕地松敗育與SOD、POD活性及MDA含量的關系

唐國強 楊章旗 黃永利

摘要： 為研究濕地松（Pinus elliottii Engelm.）雄性敗育與SOD、POD活性及MDA含量的關系，以南寧市林業科學研究所濕地松種子園中的雄性不育株和雄性可育株為試驗材料，對其小孢子葉球和針葉的SOD、POD活性及MDA含量進行測定比較。結果表明，雄性不育株和可育株濕地松小孢子葉球SOD活性在整體上差異不明顯。POD活性及MDA含量在同一時期不育株比可育株高，且差異明顯。針葉SOD和POD活性雄性不育株比可育株低，POD活性差異很明顯。針葉MDA含量雄性不育株和可育株差異不明顯。在小孢子發育過程中，SOD、POD活性及MDA含量在多數采樣時期雄性不育株小孢子葉球明顯比針葉高，而可育株小孢子葉球均比針葉低。研究認為，小孢子葉球中較高的POD活性及MDA含量可能是引起濕地松雄性敗育的重要生理原因。

關鍵詞： 濕地松（Pinus elliottii Engelm.）；雄性不育；小孢子葉球； 針葉

中圖分類號：S791.246 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）04-0943-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.04.033

Relationships between SOD，POD Enzymes Activities，MDA Content

and the Abortion of Male Sterile Pinus elliottii

TANG Guo-qiang1，2，YANG Zhang-qi3，HUANG Yong-li2

（1.College of Forestry，Guangxi University，Nanning 530004，China；2.Nanning Forestry Science Institute，Wuming 530107，Guangxi，China；

3.Guangxi Zhuang Autonomous Region Forestry Research Institute，Nanning 530001，China）

Abstract： In order to clarify the relationships between SOD， POD activities， MDA content and male sterile Pinus elliottii Engelm.， male sterile clones and male fertile clones in P. elliottii seed orchard of Nanning Forestry Science Institute were used as experimental material. SOD， POD activity and MDA content during male strobilus abortion were studied. The results were as follows， no significant difference was found in SOD activity of P. elliottii microstrobilus between male sterile clones and male fertile clones. The POD activity and MDA content of male sterile clones were higher than that of male fertile clones in the same periods； and the differences were significant. The SOD and POD activity in the needle of male sterile clones was lower than that of male fertile clones in the same periods. Moreover， the MDA content of P. elliottii needle did not differ statistically between male sterile clones and male fertile clones. In the process of microspore development， the SOD， POD activity and MDA content of male sterile clones was significantly higher than those in needle at most of periods； while SOD， POD of activity and MDA content in the microstrobilus of male fertile clones were lower than those in the needle. The research suggests that excessive POD activity and MDA content in microstrobilus might be the important physiological reasons for male sterility in P. elliottii.

Key words：Pinus elliottii Engelm.；male sterility；microstrobilus；needle

雄性不育在植物界中是一種常見現象，主要表現在有性繁殖過程中的花藥、花粉粒或雄配子發育不正常而表現出的遺傳現象[1]。早在1763年，Kolreuter就已經觀察到植物雄性不育現象，據統計已經在43個科、162個屬、320個種和297個種間雜種中發現了雄性不育現象[2]；隨著研究的不斷深入，這個數目還在不斷增加。濕地松（Pinus elliottii Engelm.）也存在雄性不育現象，其為雌雄同株異花植物，正常濕地松雌球花同枝下方著生雄球花。在松樹雜交育種中，利用雄性不育材料可免除去雄等部分工作，同時雄性不育材料的應用可以避免自交，進一步提高種子品質，因此開展濕地松雄性不育的研究對今后濕地松雄性不育材料的應用及林木雜交育種有著極其重要的意義。

目前有關林木雄性不育機理的研究和應用相對較少，主要有杉木[3，4]、楊樹[5，6]和一些小灌木如四合木[7]、大白刺[8]等，遠落后于如水稻、玉米、小麥等農作物及一些草本植物雄性不育機理研究。現在農作物良種選育及制種方面，雄性不育材料已經廣泛運用于雜交育種、輪回選擇等過程中，并起著極其重要的作用。國內關于裸子植物雄性不育的報道主要有杉木[3，9]，其他裸子植物未見有相關報道。近年在南寧市林業科學研究所濕地松種子園中發現一無性系，其小孢子葉球在其他小孢子葉球開始伸長生長時停止或減緩伸長生長，而且在其他正常無性系撒粉時小孢子葉開始干枯脫落，期間未有花粉撒出。經初步認定，其為雄性不育植株。為了解該雄性不育材料小孢子發育過程中小孢子敗育的生理機制，選用該雄性不育株和可育株為試驗材料，在小孢子發育的不同時期，測定小孢子葉球及針葉的超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）活性及丙二醛（MDA）含量變化，探討濕地松雄性不育材料小孢子敗育與SOD、POD活性及MDA含量的相關關系，現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

濕地松雄性不育株和可育株（對照）均為南寧市林業科學研究所濕地松種子園植株。樹齡都為21年生。自小孢子葉球出現較為明顯時（2013年12月12日）開始取材，到2014年2月6日結束。每株分東南西北4個方位每隔5～7 d混合取樣一次，取小孢子葉球及其附近2～3層針葉，直到小孢子葉球干枯脫落。共取樣11次。每次取下樣品后立即放入冰壺帶回室內，迅速分別處理后放入-80 ℃環境保存，備用。

1.2 方法

分別取濕地松雄性不育株及可育株每個取樣時期的0.2 g左右的小孢子葉球和針葉材料于預冷的研缽中，加預冷的磷酸緩沖液在冰浴上研磨成勻漿，在4 ℃條件下10 000 r/min離心20 min，取上清液用于SOD及POD活性的測定。SOD活性測定采用NBT（氮藍四唑）光化還原法，以抑制NBT光化還原的50%為一個酶活性單位，單位表述為U/g。POD活性測定采用愈創木酚法，以每分鐘吸光度變化值表示酶活性的大小，單位表述為ΔA470/（g·min）。MDA含量測定采用TBA（硫代巴比妥酸）法[10]。各指標均以各時期混合均勻的小孢子葉球及其附近針葉為測定材料，每樣品重復3次。所有試驗數據均采用統計軟件SPSS 21.0進行相應的分析處理。

2 結果與分析

2.1 小孢子葉球及其附近針葉SOD活性的動態變化

濕地松小孢子發育過程中小孢子葉球及附近針葉的SOD活性變化測定情況見圖1。由圖1可以看出，雄性不育株和可育株小孢子在發育過程中小孢子葉球的SOD活性波動較大，雄性不育株小孢子葉球SOD活性剛開始較高，最后較低，中間過程因波動有升有降，在2月4日小孢子葉球開始變干枯時SOD活性達到最低，干枯后回升。可育株小孢子葉球的SOD活性從剛開始起就下降，到12月31達到最低，之后回升，1月12日又開始下降，到雄球花開始撒粉時（2月初）SOD活性上升，花粉撒完后下降。11次采樣有6個時期雄性不育株小孢子葉球SOD活性比可育株高。經分析表明，雄性不育株和可育株小孢子葉球SOD活性整體差異并不明顯，但不同時期的差異很明顯。在小孢子發育過程中，小孢子葉球附近針葉的SOD活性雄性不育株與可育株差異明顯。除了1月12日外，雄性不育株小孢子附近針葉的SOD活性均比可育株的低，不過針葉的SOD活性在各個時期的變化并不明顯。雄性不育株在11個采樣時期有7個時期SOD活性小孢子葉球比針葉高，而可育株有9個時期小孢子葉球比針葉低。表明在小孢子發育過程中，SOD活性是雄性不育株小孢子葉球比針葉高，而可育株小孢子葉球比針葉低。

SOD是生物體內重要的保護酶之一，它的主要功能是催化超氧化物陰離子自由基·O2-發生歧化反應，生成H2O2和O2，從而清除·O2-，降低對細胞的損害。雄性不育株小孢子葉球中的SOD活性與可育株這些變化可能與其他酶及物質的相互調節有關。雄性不育株小孢子葉球SOD活性在小孢子葉即將干枯脫落時迅速降低，這可能與較高的POD活性及MDA含量有關。

2.2 小孢子葉球及其附近針葉POD活性的動態變化

濕地松小孢子發育過程中小孢子葉球及附近針葉的POD活性變化測定情況見圖2。由圖2可見，雄性不育株和可育株在小孢子發育過程中小孢子葉球的POD活性差異很明顯，雄性不育株小孢子葉球POD活性前期變動較小，后期下降后急速上升；可育株的POD活性前期急速下降，后期相對較為平穩，直到2月9日花粉撒完后急速下降；而不育株在小孢子葉球干枯后POD活性急劇上升；不育株與可育株小孢子葉球最初POD活性較為接近，隨著可育株POD活性的下降，可育株和不育株的POD活性差異逐步拉大，如1月6日不育株小孢子葉球POD活性是可育株的7.80倍，到1月24日縮小為1.77倍。在可育株撒粉后，兩者的POD活性差距達到最大，不育株為可育株的64.70倍。并且在同一時期內，不育株小孢子葉球的POD活性均比可育株高，這與前人的研究結果[11-14]基本是一致的，這說明濕地松雄性不育株小孢子葉球中活性氧維持在較高的水平，引起了膜脂過氧化，使其不能維持正常的生長發育，從而引起雄性敗育。而小孢子葉球附近針葉的POD活性在小孢子發育的過程中雄性不育株遠低于雄性可育株，這正好與小孢子葉球在各時期POD活性的含量變化相反。雄性不育株在小孢子發育的11個測定時期中，小孢子葉球附近針葉的POD活性均小于1ΔA470/（g·min），而雄性可育株小孢子附近針葉的POD活性最低為3.3ΔA470/（g·min），最高的達8.4ΔA470/（g·min），引起這一變化差異的原因還有待進一步研究。在取樣的11個時期，雄性不育株小孢子葉球的POD活性均比針葉高，而雄性可育株小孢子葉球的POD活性均比針葉低。這個動態變化特點與SOD活性有類似的情況。

2.3 小孢子葉球及其附近針葉MDA含量的動態變化

濕地松小孢子發育過程中小孢子葉球及附近針葉MDA含量變化測定情況見圖3。由圖3可見，雄性不育株和可育株在小孢子發育過程中小孢子葉球的MDA含量兩者差異很明顯。其中不育株小孢子葉球的MDA含量變化較大，先降后升，到1月17日達到最大；可育株的小孢子葉球MDA含量變化較小，一直維持在較低水平，在1月29日小孢子葉球生長較快時MDA含量最小，開始撒粉時上升。雄性不育株小孢子葉球MDA含量在同一時期均比可育株的高，最高時可達可育株的7.10倍，最小也有1.65倍。小孢子葉球附近針葉MDA含量雄性不育株和可育株在各采樣時期差異不明顯。小孢子發育過程中的11次采樣時期，雄性不育株MDA含量是小孢子葉球有9個時期比針葉的高，而雄性可育株MDA含量在各采樣時期小孢子葉球均比針葉的低。MDA是自由基與細胞膜的不飽和脂肪酸發生過氧化或脫脂化降解的產物。其在植物體內積累是活性氧毒害的表現，因此其含量是判斷植物脂質過氧化程度高低的重要指標。在氧化或脫脂降解過程中，膜通透性增加、離子外滲將影響細胞的正常生長和發育；已有研究證實植物中較高的MDA含量是植物雄性敗育的重要生理原因之一[11，15-18]。

3 小結與討論

目前，關于植物雄性不育機理的研究主要從細胞學、生理生化及育性基因等3個方面著手；雄性不育生理生化特性的研究目前主要是進行比較研究，而完全闡明雄性育性表達的生理生化過程的試驗研究較少。SOD、POD是植物中活性氧清除系統重要的酶，在清除植物體內的自由基、維持自由基產生與清除系統的平衡起到重要的作用。關于植物雄性不育與保護酶活性變化及活性氧代謝的關系，前人分別在小麥[19]、蔥[20]、不結球白菜[21]、辣椒[22]、油菜[18]等作物做過研究，表明活性氧代謝失調及保護酶活性異常是導致作物雄性不育的重要原因之一。但在涉及活性氧清除酶系統活性變化規律方面的試驗結果并不一致，這說明不同植物、不同敗育類型不育基因在敗育過程中存在差異表達。MDA在植物體內積累一般認為是活性氧毒害的表現。試驗里濕地松雄性不育株小孢子葉球在同一時期POD活性及MDA含量均比可育株高，差異非常明顯。SOD活性雖然在7個時期不育株比可育株高，但總體差異不大；這可能因為較高的POD活性和MDA含量抑制了SOD活性的升高所致[23]，SOD活性的變化可能與較高的POD活性及MDA含量相互作用有關。劉麗華等[12]對板栗雄性不育進行了比較，結果認為不育品種浮來無花在雄花序敗育過程中POD活性高于可育品種大紅袍。這與趙前程等[11]對花椰菜雄性不育系進行的研究結果類似，認為較高的POD活性引起雄性敗育的原因一是POD活性增高將導致花藥內源激素（IAA）的分解，影響營養物質的合成和運輸；二是較高的POD活性可能促進了雄花序中乙烯的合成，進而導致雄花序的脫落。試驗中濕地松雄性不育株小孢子葉球在同一時期POD活性及MDA含量均比可育株高，因此認為小孢子葉球中較高的POD活性及MDA含量是濕地松引起雄性敗育的重要生理原因。

試驗除了對濕地松小孢子葉球SOD、POD活性及MDA含量測定外，對小孢子附近的2～3層針葉也進行了類似的測定。結果表明，濕地松雄性不育株針葉SOD、POD活性均比可育株低，SOD活性總體差異明顯，POD活性差異很明顯，MDA含量差異不明顯。濕地松雄性不育株針葉較低的SOD、POD活性可能與小孢子葉球活性氧代謝失衡有關。周仲華等[23]對棉花溫敏雄性不育系敗育不同部位的SOD、POD活性及MDA含量測定結果顯示，棉花葉片在高溫時期SOD活性及MDA含量雄性不育株均比可育株低，而POD活性則是雄性不育株比可育株高。目前關于雄性不育與雄性可育植株間雄性器官以外的組織生理生化的研究相對較少。本試驗的結果表明，濕地松雄性不育株與可育株在小孢子發育過程中SOD、POD活性及MDA含量是不育株小孢子葉球比針葉高，可育株小孢子葉球比針葉低。這種活性氧清除系統的異常變化可能打破了葉與花的活性氧清除系統平衡，并進一步引起小孢子葉球脂膜過氧化，最終使小孢子敗育。關于這些物質在敗育過程中不同部位的變化及其相互作用關系還有待進一步系統的試驗來證實。

參考文獻：

[1] 李澤福，夏加發，唐光勇.植物雄性不育類型及其遺傳機制的研究進展[J].安徽農業科學，2000，28（6）：742-746.

[2] KAUL M L H. Male Sterility in Higher Plants[D]. New York： Springer-Verlag Press，1988.2-5.

[3] 李 平，余象煜，呂洪飛.杉木雄性不育株與可育株小孢子葉球的發育解剖和生理生化的比較研究[J].林業科學，1992（2）：115-121.

[4] 何福基，錢領元，余象煜，等.杉木雄性不育植株的初步研究[J].浙江林學院學報，1989（1）：105-106.

[5] 孟永紅.毛白楊雄株花粉敗育細胞學觀察和雙抗蟲基因轉化的研究[D].河北保定：河北農業大學，2004.

[6] 康向陽.毛白楊花粉敗育機制的研究[J].林業科學，2001，37（3）：35-39，145.

[7] 王迎春，征 榮，楊 持.四合木（Tetraena mongolica Maxim）雄性不育的細胞學研究[J].內蒙古大學學報（自然科學版），2000，31（1）：88-92.

[8] 竇振東，燕 玲，趙淑文，等.大白刺雄性不育株超微結構和生理生化特性研究[J].干旱區資源與環境，2013，27（12）：137-141.

[9] 呂洪飛，余象煜，李 平，等.杉木雄性不育株與可育株小孢子囊發育的電鏡研究[J].武漢植物學研究，1997，15（2）：97-102.

[10] 張治安，陳展宇.植物生理學實驗技術[M].長春：吉林大學出版社，2008.

[11] 趙前程，耿 宵，陳雪平，等.花椰菜雄性不育系小孢子發育過程及其POD活性[J].華北農學報，2002，17（2）：108-111.

[12] 劉麗華，李保國，齊國輝，等.雄性不育板栗雄花序敗育與幾種酶活性及MDA含量的關系[J].林業科學，2007，43（4）：121-124.

[13] 胡美華，陳竹君，汪炳良.榨菜胞質雄性不育系及其保持系若干生化特性的比較[J].浙江農業大學學報，1998（1）：59-60.

[14] 呂清璐，沈向群，汪 玉，等.美女櫻雄性不育系與可育系花器官發育過程中生理生化指標的比較分析[J].江蘇農業科學，2010（3）：221-223.

[15] 陳賢豐，梁承鄴.水稻不育花藥中H2O2的積累與膜脂過氧化的加劇[J].植物生理學報，1991，17（1）：44-48.

[16] 張明永，梁承鄴，段 俊，等.CMS水稻不同器官的膜脂過氧化水平[J].作物學報，1997，23（5）：603-606.

[17] 段 俊，梁承鄴，張明永.玉米細胞質雄性不育性與膜脂過氧化的關系[J].植物生理學通訊，1996，32（5）：331-334.

[18] 張明永，粱承鄴，段 俊，等.油菜細胞質雄性不育系發育過程中活性氧的代謝[J].植物學報，1997，39（5）：480-482.

[19] 趙會杰，劉華山，林學梧，等.小麥胞質不育系花粉敗育與活性氧代謝關系的研究[J].作物學報，1996，22（3）：365-367.

[20] 苗錦山，楊文才，李美芹，等.蔥細胞質雄性不育與花蕾發育過程中活性氧代謝關系研究[J].華北農學報，2009，24（4）：92-95.

[21] 袁建玉，侯喜林，李萍芳.不結球白菜胞質雄性不育新種質花蕾和葉片中活性氧代謝的變化[J].南京農業大學學報，2006， 29（1）：18-22.

[22] 張子學，侯喜林.辣椒細胞質雄性不育與活性氧代謝的關系[J].西北植物學報，2005，25（4）：799-802.

[23] 周仲華，朱四元，陳金湘.棉花溫敏雄性不育與膜脂過氧化的關系研究[J].江西農業大學學報，2007，29（4）：518-521.