麻類脫膠菌的木糖發酵性能改造及初步檢驗

李智敏 嚴理 朱作華 等

摘要：通過引入丙酮酸脫羧酶和乙醇脫氫酶基因改造麻類脫膠優良菌株Ym68，以使其獲得利用木糖發酵產生乙醇的能力。結果表明，雖然基因工程菌株PAP16的木糖利用率相對原始菌株Ym68差別不大，但明顯提高了代謝產物乙醇。在5%木糖發酵試驗中，原始菌株Ym68的木糖發酵液中乙醇含量低于0.2%，而改造后的菌株PAP16木糖發酵液的乙醇含量上升到1.6%。盡管此次基因改造可能影響了菌體表面特性，使得PAP16菌株容易形成凝聚而降低脫膠活性；但該菌株同時具備了脫膠預處理和產生目的產物乙醇兩種性能，這對研究原料預處理和提高原料利用率較為有利。

關鍵詞：脫膠菌；木糖發酵；乙醇

中圖分類號：S563；S216 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）04-1031-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.04.054

Genetic Engineering of the Xylose Fermentation Property in Hemp

Degumming Bacteria and Preliminary Testing

LI Zhi-min，YAN Li，ZHU Zuo-hua，XIE Chun-liang，HU Zhen-xiu，PENG Yuan-de

（Institute of Bast Fiber Crops，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Changsha 410205，China）

Abstract：For the advantage of high cellulose content， bast fiber crops are used as raw materials in the research of cellulosic fuel ethanol. The bacterial degumming technics is the most economical and environmentally friendly pretreatment methods in the bast cellulosic ethanol research. In this study， by constructing an expression plasmid of both pyruvate decarboxylase and alcohol dehydrogenase genes，the fine degumming bacterial strains Ym68 is genetically engineered to gain a xylose fermentation property to yield ethanol. By comparing the Ym68 and PAP16 fermentations of 5% xylose liquid medium，the results showed that though the xylose utilization of genetically engineered strain PAP16 is little difference to that of original strain Ym68，but the ethanol concentration in the fermentation broth rised from 0.2% to 1.6%. Despite this genetically engineering may change the bacterial cell surface， which led to cell aggregation and thus tempted to reduce the ability of degumming，but PAP16 is favorable for the study of raw materials pretreatment and utilization by having two kinds of properties， which are degumming and ethanol production.

Key words： degumming bacteria； xylose fermentation； ethanol

紅麻、苧麻等麻類作物纖維含量高、糖化效果好，被認為是制備纖維質燃料乙醇的良好原材料[1，2]。對紅麻、苧麻等纖維原料糖化之前需先對其進行脫膠處理，使果膠、半纖維素等物質降解，有利于后續纖維素的酶解糖化[3]。而利用微生物進行麻類脫膠是一種高效清潔型的脫膠方式[4]，既減少用水量又避免酸堿等化學物質對后續酶解糖化的影響，因此微生物脫膠是麻類纖維制備燃料乙醇的理想預處理方法。微生物脫膠過程中會去除麻類果膠、半纖維素等物質，約占干物質的10%～20%[5]。從酶活和成分測定等方面分析，脫膠去除的成分當中含有大量的木糖、葡萄糖、甘露糖和阿拉伯糖等[6，7]。

本研究以脫膠菌Ym68[8]為研究對象，通過雙基因表達質粒載體pACYCDuet-1把丙酮酸脫羧酶（PDC）和乙醇脫氫酶（AdhB）基因轉化到脫膠菌Ym68中，以期使其能脫膠并同時利用脫膠液糖分用于發酵產生乙醇。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株及載體

麻類脫膠菌株Ym68為中國農業科學院麻類研究所選育的菌株。酮酸脫羧酶基因PDC和乙醇脫氫酶基因AdhB模板來源于KO11菌株基因組。雙基因表達質粒載體pACYCDuet-1購于Voergen公司。

1.2 引物設計

利用Primer premier 5.0軟件對PDC和AdhB基因的開放閱讀框（ORF）序列設計引物。以pACYCDuet-1的多克隆位點1（MCS1）中的SalⅠ作為PDC基因的插入點，而多克隆位點2（MCS2）中的XhoⅠ作為AdhB基因的插入位點。PDC和AdhB基因引物加上酶切位點和保護堿基，并設計1對針對MCS1和MCS2多克隆位點載體構建的檢測引物，引物序列如表1所示。

1.3 PDC和AdhB基因克隆

以KO11菌液為模板，進行PCR擴增。PCR反應體系為：模板菌液1 μL，Buffer 2.0 μL，dNTPs 0.4 μL，引物A 0.5 μL，引物B 0.5 μL，DNA polymerase 0.2 μL，ddH2O 15.4 μL。PCR反應程序為：94 ℃預變性4 min；35個循環（94 ℃變性30 s，Tm退火40 s，72 ℃延伸45 s）；72 ℃延伸10 min。S-PDC-F和S-PDC-R引物退火溫度54 ℃，X-AdhB-F和X-AdhB-R引物退火溫度55 ℃。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠回收試劑盒純化。PDC和AdhB兩個基因的純化產物分別用SalⅠ和XhoⅠ進行單酶切，回收產物-70 ℃保存備用。

1.4 PDC和AdhB雙基因表達載體構建

將含有pACYCDuet-1質粒的DH5α菌株經37 ℃、170 r/min過夜培養后提取質粒，并用SalⅠ單酶切后通過凝膠回收。PDC基因片段的SalⅠ酶切回收產物和pACYCDuet-1質粒的SalⅠ酶切回收產物按3∶1的比例，用T4 DNA 連接酶進行連接，并轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞[9]。然后將AdhB基因片段和pACYCDuet-1-PDC質粒的XhoⅠ酶切回收產物按濃度3∶1的比例混合連接過夜。菌液PCR鑒定陽性菌，并將陽性菌種送至南京金斯瑞生物科技有限公司進行測序鑒定。

1.5 Ym68陽性菌株鑒定

根據噬夏孢歐文氏菌感受態的方法[10]制備Ym68菌株感受態細胞。從含有pACYCDuet-1-PDC-AdhB質粒的大腸桿菌DH5α菌株中提取質粒，參考Sambrook等[11]的轉化方法。用含100 μg/mL氯霉素的0.5%葡萄糖肉湯固體培養基進行篩選。隨機挑取20個陽性菌落在0.5%葡萄糖肉湯液體培養基（含100 μg/mL氯霉素）中擴繁。以MCS1-F和MCS2-R引物進行PCR鑒定陽性菌株。

1.6 木糖發酵及檢測

將Ym68和PAP16菌株分別接種于肉湯培養基（0.5%葡萄糖、1%牛肉膏和0.5%酵母粉）中，35 ℃、180 r/min培養到OD600 nm為0.8左右時作為菌種。Ym68和PAP16菌株分別按5%的接種量接種到250 mL發酵培養基（5%木糖、1%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物和1% NaCl）中，以不接種的發酵培養基作為對照，6個重復，35 ℃、180 r/min進行發酵，72 h時進行還原糖濃度和乙醇濃度檢測。每個處理的6個重復樣品中兩兩混合，形成3份混合樣品，隨后取每份樣品進行總糖濃度檢測；以未發酵過的發酵培養基為對照。按DNS顯色法檢測還原糖濃度[12]；以濃度為0、0.1%、0.2%、0.4%、0.8%和1.2%的木糖作標準曲線，隨后對樣品進行原糖濃度測定；混合樣品經蒸餾后用酒精計法測定[13]。

1.7 苧麻脫膠

分別將初始菌株Ym68和工程菌株PAP16分別接種于肉湯培養基中，35 ℃、180 r/min培養菌株過夜作為菌種（OD600 nm為1.5左右）。以加肉湯培養基為對照，分別用Ym68和PAP16菌種進行脫膠試驗，稱取每份15 g的苧麻放于500 mL三角瓶中用于脫膠試驗，35 ℃、150 r/min培養8 h，每個處理3個重復。脫膠效果根據11分級[14]，經清水洗去可溶性物質并烘干后計算脫膠前后的干物質損失率。

1.8 菌液涂片顯微觀察

Ym68轉化pACYCDuet-1空質粒的菌株命名為Ym68-K。將Ym68、Ym68-K和PAP16菌株分別接種于肉湯培養基中，35 ℃、180 r/min轉速恒溫搖床培養過夜。培養好的菌液立即用于涂片，用結晶紫染色后用顯微鏡觀察、拍照。

2 結果與分析

2.1 pACYCDuet-1-PDC-AdhB載體的構建

利用XhoⅠ單酶切位點在多克隆位點MCS2上插入的PDC基因長度為1 707 bp，而在多克隆位點MCS1上插入的AdhB基因為1 152 bp，如圖1所示。將兩個基因插入pACYCDuet-1載體質粒后，提取質粒用XhoⅠ和SalⅠ雙酶切。結果表明，1 500～2 000 bp間存在一條目的條帶，而約1 000 bp處也存在一條目的條帶，分別與PDC和AdhB基因大小相符，如圖2所示。而在3 000～5 000 bp間有一條較亮的條帶，在約500 bp處還有一條弱帶，這兩條帶與原始質粒雙酶切位置大小相符。結果表明，pACYCDuet-1-PDC-AdhB表達載體構建成功。

2.2 PAP16具有木糖發酵能力

對Ym68轉化pACYCDuet-1-PDC-AdhB質粒后，隨機對5號、6號、16號和20號陽性單菌落進行PCR鑒定。單菌落與帶有pACYCDuet-1-PDC-AdhB質粒的大腸桿菌DH5α擴增的條帶大小一致，與預期載體構建后MCS1-F 和MCS2-R引物間的產物長度（約3 300 bp）相符；而原始菌株Ym68則未擴增出該條帶，如圖3所示。結果表明，帶有pACYCDuet-1-PDC-AdhB質粒的Ym68工程菌株構建成功，16號菌株命名為PAP16。

用Ym68和PAP16菌株對含有5%木糖的發酵培養基進行發酵試驗。從發酵后的還原糖濃度看，PAP16和Ym68對木糖的利用率基本相似。72 h發酵的Ym68菌株發酵液中還原糖濃度約為0.56%，而PAP16菌株發酵液的還原糖濃度約為0.23%；未經發酵的發酵培養基還原糖濃度為5.22%。從乙醇產量方面看，PAP16菌株發酵液乙醇濃度約為1.6%，而Ym68菌株的在0.2%以下；未發酵的培養基則未量出讀數，如圖4所示。結果表明， Ym68原始菌被改造成PAP16后雖然對木糖利用率的影響不明顯，但發酵生成乙醇的能力提高。

2.3 PAP16苧麻脫膠性能

為檢驗PAP16的脫膠能力，通過苧麻脫膠試驗對比Ym68和PAP16脫膠性能，結果如圖5所示。只加培養基處理的對照無脫膠效果，干物質損失率在1%以下；Ym68菌株的脫膠級數達到10級，干物質損失率為12%左右；而PAP16脫膠級數為7級，干物質損失率為8%左右。從試驗重復結果看，PAP16菌株的脫膠能力稍有減弱。在菌株的培養過程中發現，靜置后的PAP16菌液相比Ym68更容易出現菌體沉淀。因此，對懸浮后的菌液涂片觀察，PAP16菌液中菌體呈凝聚狀態，而Ym68和轉化有pACYCDuet-1空質粒的Ym68-K菌液其菌體則比較分散（圖6），PAP16的菌體凝聚特性可能影響了其脫膠性能。

3 小結與討論

脫膠菌株Ym68具有優良的苧麻脫膠性能，PDC和AdhB基因構建進去后其獲得了發酵木糖產乙醇的能力。Ym68菌株屬于歐文氏菌屬，而歐文氏菌一般均可利用戊糖和己糖[15，16]，試驗結果也證明Ym68菌株可以利用木糖。其發酵液乙醇濃度小于0.2%可能是誤差形成的結果，而并非真正產生乙醇。PAP16發酵液中乙醇濃度達到1.6%、糖醇轉化率達到24%，說明將丙酮酸脫羧酶基因PDC和乙醇脫氫酶基因AdhB引入Ym68菌中使其獲得了將木糖轉化乙醇的能力。已早有類似研究報道，整合PDC和AdhB基因的大腸桿菌，其產生乙醇的能力也是從無到有[17]。這些說明Ym68菌株本身具有吸收木糖的能力，但引入PDC和AdhB基因后使得木糖代謝往乙醇產物方向轉化。引入PDC和AdhB基因可能改變了Ym68菌體表面特征使得該基因工程菌容易形成凝聚，從而降低了其脫膠性能。通過改造代謝途徑使得麻類預處理菌株獲得利用木糖轉化成乙醇產物的能力，這對研究提高麻類原料利用率和推進麻類燃料乙醇技術提供了可借鑒的依據。

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