知柏地黃湯對解脲脲原體感染模型大鼠精子線粒體NADH脫氫酶mRNA、ATP合成酶mRNA表達的影響*

賓東華何清湖韓 忠陳虹歷李迎秋劉朝圣

1. 湖南中醫藥大學（湖南 長沙 410208）；2. 湖南中醫藥大學第一附屬醫院

知柏地黃湯對解脲脲原體感染模型大鼠精子線粒體NADH脫氫酶mRNA、ATP合成酶mRNA表達的影響*

賓東華1，2何清湖1**韓 忠1陳虹歷1李迎秋1劉朝圣1

1. 湖南中醫藥大學（湖南 長沙 410208）；2. 湖南中醫藥大學第一附屬醫院

目的 研究知柏地黃湯對解脲脲原體（UU）感染模型大鼠精子線粒體NADH脫氫酶mRNA、ATP合成酶mRNA表達的影響。方法 取體質量為（220±10）g 雄性SD大鼠80只，隨機分成假手術組、模型組、中藥組（知柏地黃湯）、西藥組（強力霉素）、中西藥組（知柏地黃湯+強力霉素），造模成功后，假手術組與模型組給予等量的生理鹽水灌胃，治療組（中藥組、西藥組和中西藥組）給予相應的藥物灌胃，連續用藥21d。末次給藥24h后取標本，采用常規精液檢測法檢測精液質量，RT-PCR法檢測精子NADH脫氫酶mRNA、ATP合成酶mRNA表達。結果 假手術組、模型組、中藥組、西藥組、中西藥組大鼠精子NADH脫氫酶mRNA表達水平分別為0.44750±0.017078、0.24750±0.015000、0.34250±0.017078、0.36500±0.012910、0.39400±0.012100；ATP合成酶mRNA表達水平分別為0.36500±0.012910、0.27250±0.009574、0.35250±0.018930、0.34750±0.017078、0.39500±0.012910；直線速度分別為（12.93±1.08）μm/s、（6.24±1.13）μm/s、（12.78±0.92）μm/s、（10.43±1.32）μm/s、（13.54±1.16）μm/s；平均速度分別為（20.32±2.08）μm/s、（12.48±3.54）μm/s、（20.48±2.16）μm/s、（17.12±3.15）μm/s、（21.72±1.83）μm/s。中西藥組NADH脫氫酶mRNA、ATP合成酶mRNA表達水平與模型組、中藥組、西藥組比較均有上升，差異均有統計學意義（P＜0.01），中西藥組精子運動速度與模型組、中藥組、西藥組比較均上升，差異均有統計學意義（P＜0.01）。結論 UU感染大鼠模型精子運動速度及NADH脫氫酶mRNA、ATP合成酶mRNA表達水平變化，提示其可能是UU感染所致不育癥的機制之一。

知柏地黃湯； 解脲支原體； 精子； NADH脫氫酶； ATP合成酶

目前不孕不育已經成為一個重大的公共衛生問題，日益受到政府與醫學界的重視。在各種不育因素中，男性因素約占30%～50%［1］，生殖道感染是男性不育的重要危險因素，而解脲脲原體（UU）的感染率最高［2］。研究表明，男性生殖道UU感染可致生精細胞內出現空泡化線粒體，干擾精子的發生及成熟，從而引起精子數目減少、活力下降、畸形率增加及膜破損等微結構變化，進而導致不育［3］。精子中段的線粒體鞘，通過氧化磷酸化合成ATP，在精子運動過程中為精子尾部鞭毛供給所需能量［4］，精子線粒體能量合成障礙將降低精子活力及受精能力。線粒體氧化磷酸化的電子傳遞鏈主要由多個復合蛋白體組成，復合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ等［5］。NADH脫氫酶（復合酶Ⅰ）是線粒體呼吸鏈的起始酶，在線粒體呼吸鏈中扮演著重要的角色，為氧化磷酸化-電子呼吸鏈的入口點，2個電子從NADH進入電子傳遞鏈，伴有線粒體基質中釋放的4個質子，再通過復合酶Ⅲ、Ⅳ的協作，完成10個質子的跨膜易位，最終為ATP合成酶（復合酶Ⅴ）合成ATP提供動力［6，7］。

本文在以往UU感染導致男性不育患者的精子活力下降的臨床觀察研究基礎［8］之上，為了進一步探討知柏地黃湯治療UU感染所致男性不育癥的部分機制，我們通過動物實驗的方法檢測知柏地黃湯對UU感染大鼠精子質量及NADH脫氫酶mRNA、ATP合成酶mRNA表達水平的影響來揭示其部分治療機制，現報道如下。

材料與方法

一、材料

（一）實驗動物

SPF級12～14周齡雄性SD大鼠80只，體質量（220±10）g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，［實驗許可證號：SCXK（湘）2013-0004］，常規飼養。

（二）主要試劑與藥物

TRIzol試劑（Invitrogen公司，美國）、NADHmRNA、ATPmRNA引物（生工生物工程股份有限公司）。解脲脲原體（UU）標準株由南華大學微生物學教研室提供，將UU標準菌株（凍干品）復蘇，接種，體外實驗用效價為10×106ccu/mL的菌液。

知柏地黃湯（熟地黃24g、淮山藥12g、山萸肉12g、茯苓（不去皮）9g、澤瀉9g、牡丹皮9g、鹽知母6g、鹽黃柏6g），藥物炮制及用量基本按《醫宗金鑒》所載執行。按以上用藥比例在湖南中醫藥大學第一附屬醫院中藥房購買藥材，采用水煎后制備成0.94g生藥/mL煎劑備用。強力霉素（鹽酸多西環素片，江蘇聯環藥業股份有限公司，國藥準字號：H32021266），0.1g/片，臨用時用滅菌注射用水配成含強力霉素2mg/mL濃度的混懸液。

（三）實驗儀器

ABI-7300型PCR擴增儀（美國，ABI公司）、組織勻漿機（FLUKO，PRO200），核酸蛋白分析儀，蝸旋震蕩器（青浦瀘西儀器廠、K30），臺式微量離心機等。

二、方法

（一）模型建立

（2）造成財政資源浪費。安排財政專項，是基于各部門要完成特定的任務，如果項目執行進度慢，資金一直“趴在”賬上不動，資金的使用效益就無從談起，從另一個方面也反映了相關部門任務沒完成，要不錢怎么會“花”不出去，影響高校事業的健康發展。到年底，為了完成進度，必然盲目突擊花錢，資金沒用在“刀刃”上，造成了財政資金的浪費。

參照李楠等［9］造模方法。從80只SD大鼠中隨機抽取65只，建立UU感染動物模型，余下15只注射生理鹽水。于接種后的第10天隨機取出5只造模大鼠處死，取大鼠附睪剪碎組織液運用培養法檢測UU，判斷造模成功否。

（二）動物分組與給藥

動物造模成功后，隨機分為模型組（知柏地黃湯）組、西藥（強力霉素）組、中西藥（知柏地黃湯組+強力霉素）組，同時設假手術對照組，每組15只大鼠。各治療組給相應藥物灌胃，假手術組、模型對照組給等量生理鹽水灌胃，每日2次。知柏地黃湯組給藥量為（8.56g生藥/kg·d-1）（按體表面積計算相當60 kg成人用量），強力霉素組給藥量為（20mg/kg·d-1），中西組給予等量的知柏地黃湯與強力霉素。各組均連續灌胃21d。

（三）取材與指標檢測

1. 精子懸液制備及精子活力檢測：頸椎脫臼處死老鼠后，無菌操作取一側附睪放入盛有5mL已預熱至37℃PBS液的無菌玻皿中，剪碎，搖勻，將含有精子的培養皿置37℃ CO2培養箱中，充分擴散5min，制備精子懸液。用PBS液按1：5比例稀釋精子懸液，充分搖勻后置于37℃電子顯微鏡下觀察，用×4倍顯微攝錄相機記錄精子運動圖像，并用精子動態檢測系統進行精子運動參數測定［10］。

2. 精子細胞NADH脫氫酶mRNA、ATP合成酶mRNA檢測：取精子懸液，按照逆轉錄試劑盒操作步驟進行，引物序列：從NCBI中下載以下基因序列，引物設計采用Primer 5.0軟件，引物序列見表1。

表1　引物序列

（四）統計學處理

結 果

于接種后的第10天隨機取出5只造模大鼠處死，取附睪剪碎組織液運用培養法檢測UU，5只大鼠均培養出UU，說明造模成功。治療后處死各組大鼠，取附睪剪碎組織液培養UU，結果顯示：假手術組未培養出UU，模型組培養UU陽性率93.3%（14/15），中藥組培養UU陽性率33.3%（5/15），西藥組培養UU陽性率26.7%（4/15），中西藥組培養UU陽性率20%（3/15）。與假手術組比較，模型組UU陽性率高，兩組間比較差異具統計學意義（P＜0.01）。與模型組比較，中藥組、西藥組、中西藥組培養UU陽性率均降低，差異均具統計學意義（P＜0.05）。中藥組、西藥組的UU陽性率與中西藥組比較差異無統計學意義（P＞0.05）

二、各組大鼠精子質量及精子運動參數的比較

從表2可看出：與模型組比較，假手術組及各治療組精子直線速度、平均速度均有上升，差異有統計學意義（P＜0.01）。與西藥組比較，假手術組及中藥組和中西藥組精子直線速度、平均速度均有上升，差異有統計學意義（P＜0.01）。

表2　各組大鼠精子運動參數比較（±s，n=15n=15）

表2　各組大鼠精子運動參數比較（±s，n=15n=15）

注：與模型組比較，*為P＜0.01；與西藥組比較，△P＜0.01

組別 　n 直線速度（μm/s） 平均速度（μm/s）假手術組 　15 　12.93±1.08*△　20.32±2.08*△模型組 　15　6.24±1.13　12.48±3.54中藥組 　15　12.78±0.92*△　20.48±2.16*△西藥組 　15　10.43±1.32*　17.12±3.15*中西藥組 　15　13.54±1.16*△　21.72±1.83*△

三、各組大鼠精子線粒體NADH脫氫酶mRNA、mRNA ATP合成酶mRNA表達的比較

從表3、圖1可看出：與假手術組比較，模型組及各治療組精子線粒體NADH脫氫酶mRNA表達水平下降，差異具統計學意義；ATP合成酶mRNA表達水平模型組有下降，而中西藥組上升，差異有統計學意義（P＜0.01），中藥組和西藥組均有下降，但差異無統計學意義（P＞0.05）。與模型組比較，各治療組線粒體NADH脫氫酶mRNA、ATP合成酶mRNA表達水平均有上升，差異有統計學意義（P＜0.01）。與中西藥組比較，中藥組與西藥組線粒體NADH脫氫酶mRNA、ATP合成酶mRNA表達水平均下降，差異均有統計學意義（P＜0.01、P＜0.05）。

表　3大鼠精子線粒體NADH脫氫酶mRNAA　、ATP合成酶mRNA表達水平情況（±s）

表　3大鼠精子線粒體NADH脫氫酶mRNAA　、ATP合成酶mRNA表達水平情況（±s）

注：與假手術組比較，▲P＜0.01，▲▲P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.01，**P＜0.05；與中西藥組比較，△P＜0.01，△△P＜0.05

組別 n 　NADH mRNA　ATP mRNA假手術組 15 　0.44750±0.017078　0.36500±0.012910模型組 15　0.24750±0.015000▲　0.27250±0.009574▲中藥組 15　0.34250±0.017078▲*△　0.35250±0.018930*△西藥組 　15　0.36500±0.012910▲*△△　0.34750±0.017078*△中西藥組 15　0.39400±0.012100▲**　0.39500±0.0012910▲*

圖1　NADH脫氫酶mRNA、ATP合成酶mRNA表達

討 論

精子的運動，特別是快速前向運動能力在男性生殖中具有重要的意義，精子運動能力與精子線粒體的功能密切相關。線粒體作為細胞最重要的細胞器，為生命活動提供基本能量。線粒體是精子運動的供能中心，線粒體的呼吸功能正常與否與精子的運動能力直接相關。線粒體供能主要通過位于線粒體內膜上的5個呼吸鏈復合酶完成，即：NADH脫氫酶（復合體Ⅰ）、琥珀酸-Q氧化還原酶（復合體Ⅱ）、UQ-細胞色素C氧化還原酶（復合體Ⅲ）、細胞色素C氧化酶（復合體Ⅳ）和ATP合成酶（復合體Ⅴ）［11］。

我們課題組的前期研究發現UU感染可以導致精子質量下降［8］，本次動物實驗再次證實UU感染后大鼠精子直線速度及平均速度均有下降，而知柏地黃湯干預后精子質量參數均有改善。我們通過實驗研究發現，UU感染后大鼠精子線粒體NADH脫氫酶mRNA、ATP合成酶mRNA表達水平均有下降，兩者間可能存在一定的聯系，因此，我們猜測引起UU感染所致精子質量下降的內在原因可能是UU感染破壞精子結構，引起大鼠精子線粒體NADH脫氫酶mRNA、ATP合成酶mRNA表達水平下降，精子線粒體呼吸功能受損，ATP生成障礙，精子運動供能降低，從而導致精子的質量發生改變，精子的直線速度及平均速度降低。

中醫學認為UU感染性不育（精子活力低下）其病機多以陰虛為本，濕熱為標；其病因多為房室不潔或攝養失慎，染及穢濁之毒，侵入前陰，浸淫于上，阻于膀胱，擾及精室，致局部氣血運行滯塞，濕熱蘊結熏蒸，濕熱穢濁之邪纏綿不愈，濁毒久戀，化火傷陰，伐傷腎陰導致腎陰不足，腎精虧虛，無以化陰陽而生精養精，或虛火灼精，使精少、活力低下而不育；本病病位在下焦，以腎陰虧虛為本，濕熱為標，病性屬虛實夾雜之證，以虛為主，其基本病機為腎陰虧虛，兼有濕熱瘀滯。故在臨床中運用滋陰補腎、清熱利濕、解毒化濁的知柏地黃丸為基本方治療取得了滿意臨床療效。

知柏地黃丸出自《醫宗金鑒》，由六味地黃丸加知母、黃柏而成。六味地黃丸之“三補”，即熟地黃滋補腎陰，山茱萸滋腎益肝，山藥滋腎補脾，共成三陰并補而以補腎為主。丹皮、茯苓、澤瀉為“三瀉”，合用以淡滲利濕，苦以燥濕，且澤瀉尚能瀉腎中之熱，利水而不傷陰。加上知母清熱瀉火、滋陰潤燥，與苦寒之黃柏相須為用，更增強了滋腎陰清相火的作用。以上諸藥，滋陰補腎，清熱利濕，頗合 UU感染性不育腎虛為本、濕熱為標之病機，為治療本病之中醫基本方，臨證加減每多取效［8，12］。

本實驗發現UU感染可導致大鼠精子直線速度、平均速度及線粒體NADH脫氫酶mRNA、ATP合成酶mRNA表達水平均有下降，這可能是UU感染所致男性不育患者精子活力低下的病理機制之一。知柏地黃湯干預后，大鼠精子直線速度、平均速度及線粒體NADH脫氫酶mRNA、ATP合成酶mRNA表達水平均有上升，其中知柏地黃丸+強力霉素組的上升最為明顯，且UU感染率明顯降低，與模型組比較，有顯著性差異，說明中西結合治療可有效殺滅UU，改善UU感染后大鼠精子質量，提高精子運動能力，上調線粒體NADH脫氫酶mRNA、ATP合成酶mRNA表達水平，增加線粒體ATP的生成，這與以往研究發現精子活力與精子線粒體功能呈正相關性的結論是一致的［13］。

本研究結果表明，知柏地黃湯可能通過增加線粒體NADH脫氫酶mRNA、ATP合成酶mRNA表達水平，提高精子線粒體呼吸功能，增強精子線粒體能量產生，提高精子供能，從而達到提高精子運動能力的目的。

1 楊華君， 惠亞， 施尚鵬， 等. 解脲脲原體和沙眼衣原體感染對男性不育影響的Meta分析. 中國男科學雜志 2015；29（5）： 36-42

2 周興， 何清湖， 周青， 等. 1599例前列腺液標本支原體感染檢測及藥敏結果分析. 中國性科學 2014； 23（12）： 9-11

3 何清湖. 中西醫結合男科學. 北京： 人民衛生出版社，2005： 254-283

4 Stendardi A， Focarelli R， Piomboni P， et al. Evaluation of mitochondrial respiratory efficiency during in vitro capacitation of human spermatozoa. Int J Androl 2011；34（3）： 247-255

5 Schoepe M， Schrepper A， Schwarzer M， et al. Exercise can induce temporary mitochondrial and contractile dysfunction liked to impaired respiratory chain complex activity. J Metabolism 2012； 61（1）： 117-126

6 Watt IN， Montgomery MG， Runswick MJ， et a1. Bioenergetic cost of making an adenosine triphosphate molecule in animal mitochondria. Proc Natl Acad Sci US A 2010； 107（39）： 16823-16827

7 Moser CC， Farid TA， Chobot SE， et a1. Electron tunnelin chains of mitochondria. Biochim Biophys Acta 2006；1757（9-10）： 1096-1109

8 鄭毅春， 何清湖， 盧芳國. 中西醫結合治療解脲脲原體感染性不育癥56例. 中華中醫藥學刊 2002； 20（11）： 109-110

9 李楠， 林鴻春， 聶晶， 等. 解脲支原體感染動物模型的研究進展. 中國性科學 2015； 24（1）： 64-66

10 何清湖， 郭炫佐， 郭軍華， 等. 知柏地黃湯對解脲支原體感染大鼠生精細胞TRPV1、TRPV5表達的影響. 中國中西醫結合雜志 2015； 35（10）：1218-1222.

11 徐婷， 李華， 魯珊珊， 等. 線粒體電子傳遞呼吸鏈及其生物學意義的研究進展. 復旦學報·醫學版 2015； 42（2）：250-255， 261

12 郭軍華， 何清湖. 滋陰補腎法防治男性不育癥的實驗研究進展. 湖南中醫藥大學學報 2014； 34（6）： 57-60

13 Ferramosca A， Provenzano SP， Coppola L， et al. Mitochondrial respiratory efficiency is positively correlated with human sperm motility. Urology 2012；79（4）： 809-814

（2016-05-08收稿）

Effect of Zhibai Dihuang Decoction on the expressions of sperm mitochondrial NADH dehydrogenase and ATP synthase in rat model of Ureaplasma urealyticum infection*

Bin Donghua1，2， He Qinghu1**，Han Zhong1， Chen Hongli1， Li Yingqiu1， Liu Chaosheng1
1. Hunan University of Traditional Chinese Medicine，Changsha 410208， China； 2. The First Affi liated Hospital of Hunan University of Traditional Chinese Medicine
Corresponding author： He Qinghu， E-mail： hqh1111@tom.com； Tel： 13787105021

Objectivee To investigate the effects of Zhibai Dihuang Decoction on the expressions of sperm mitochondrial NADH dehydrogenase and ATP synthase in rat model of Ureaplasma urealyticum （Uu） infection. Metthhooddss Total of 80 male SD rats with body mass of （220+10）g were randomly divided into sham operation group，model group， Chinese medicine group （Zhibai Dihuang Decoction）， western medicine group （doxycycline）， western group （Zhibai Dihuang Decoction plus doxycycline）， After rat models were successfully established， rats in the sham operation group and the model group were given equal amount of normal saline， and rats in the treatment groupwere intragastrically given the corresponding medicine， and the drug was administered continuously for 21 days. During 24 hours after the last administration， semen samples were collcetd， and the semen quality was detected by routine semen detection. RT-PCR was used to detect the expression of NADH dehydrogenase and ATP synthase in sperm. Results The expression levels of sperm NADH dehydrogenase in the control group， model group， Chinese medicine， western medicine group， the group of Chinese and western of rat were 0.44750±0.017078， 0.24750±0.015000， 0.34250±0.017078，0.36500±0.012910， and 0.39400±0.012100 respectively； The expression levels of ATP synthetase were 0.36500±0.012910，0.27250±0.009574， 0.35250±0.018930， 0.34750±0.017078 and 0.39500±0.012910 respectively； Linear velocity were（12.93±1.08）μm/s， （6.24±1.13）μm/s， （12.78±0.92）μm/s， （10.43±1.32）μm/s， （13.54±1.16）μm/s； Average speed of（20.32±2.08）μm/s， （12.48±3.54）μm/s， （20.48±2.16）μm/s， （17.12±3.15）μm/s， （21.72±1.83）μm/s. the expression levels of NADH dehydrogenase and ATP synthase in Chinese and western group level were signifi cant increased compared with that in the model group， Chinese medicine group， western medicine group （P＜0.01）， and sperm motility， vitality， motion velocity were also remarkably increased， the differences were statistically signifi cant （P＜0.01）. Conclusionusion The change of sperm motility rate and the expression of NADH dehydrogenase and ATP synthase may be one of the mechanisms of UU infection-caused infertility.

Zhibai Dihuang Decoction； ureaplasma urealyticum； Spermatozoa； NADH dehydrogenase；ATP synthase

10.3969/j.issn.1008-0848.2016.07.001

R 698.2

資助：國家自然科學基金資助項目（81373641，81603634）；湖南省中醫藥管理局課題資助項目（2015101）

**

，E-mail： hqh1111@tom.com；Tel： 13787105021