細胞外調節蛋白激酶信號通路對蛛網膜下腔出血大鼠神經元自噬及早期腦損傷的影響①

劉俊杰，趙雅寧，劉仁杰，丁家杉，陳禹廷，徐繼偉，李建民，田景瑞

細胞外調節蛋白激酶信號通路對蛛網膜下腔出血大鼠神經元自噬及早期腦損傷的影響①

劉俊杰1，趙雅寧1，劉仁杰1，丁家杉1，陳禹廷1，徐繼偉1，李建民2，田景瑞3

目的探討細胞外調節蛋白激酶（ERK）信號通路在蛛網膜下腔出血（SAH）后早期腦損傷及海馬區神經細胞自噬中的作用。方法成年雄性Sprague-Daw ley大鼠48只，隨機數字表法分為假手術組（Sham組）、SAH組、SAH+二甲基亞砜（DMSO）組和SAH+U0126組，每組各12只。采用血管內穿刺法制作SAH模型。造模前30m in，SAH+U0126組經尾靜脈注射U0126 0.05mg/ kg，Sham組和SAH組注射等體積生理鹽水，SAH+DMSO組注射等體積DMSO，24 h后處死。干濕重法測量腦組織水含量，HE染色觀察海馬CA1區神經細胞形態結構，免疫組化及Western blotting檢測海馬區磷酸化ERK（p-ERK）及Beclin-1和LC3-Ⅱ表達水平。結果與Sham組比較，SAH組腦組織含水量增加（P＜0.05），大鼠海馬CA 1區神經元數量明顯減少（P＜0.05），p-ERK及Beclin-1和LC3-Ⅱ的表達升高（P＜0.05）。與SAH組相比較，SAH+U0126組腦組織含水量升高（P＜0.05），海馬CA1區神經元數量減少（P＜0.05），p-ERK及Beclin-1、LC3-Ⅱ的表達降低（P＜0.05）；SAH+DMSO組各項無顯著性差異（P＞0.05）。結論ERK信號通路的激活可能通過對自噬的調控減輕SAH后的早期腦損傷。

蛛網膜下腔出血；早期腦損傷；自噬；細胞外調節蛋白激酶；大鼠

1　材料與方法

1.1實驗動物及分組

清潔級雄性Sprague-Daw ley大鼠48只，體質量350～400 g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證號SCXK（京）2009-003。飼養于華北理工大學動物實驗中心，自由進食水。適應性喂養2周。

采用隨機數字表法將大鼠分為假手術組（Sham組）、蛛網膜下腔出血組（SAH組）、蛛網膜下腔出血+二甲基亞砜組（SAH+DMSO組）和蛛網膜下腔出血+ ERK抑制劑組（SAH+U0126組），每組12只。

1.2試劑與儀器

二甲基亞砜、ERK抑制劑U0126：美國SIGMA公司。磷酸化ERK（p-ERK）抗體：美國CST公司。微管相關輕鏈蛋白3（LC3）-Ⅱ、BCL-2相關蛋白（Beclin-1）：日本MBL公司。內參Tubulin：美國ABCAM公司。二抗及顯色用品：美國KPL公司。其他免疫組化及Western blotting輔助用品：武漢博士德生物技術有限公司。

820-Ⅱ型切片機：德國LEICA公司。TP-1型攤片機：天津天利機電公司。大鼠腦立體定向儀：上海奧爾科特生物科技有限公司。Motic-6.0圖像采集及分析系統、BHS顯微鏡：日本OLYMPUS公司。攝影生物光學顯微鏡：日本NIKON公司。低溫離心機：江蘇省金壇市醫療儀器廠。酶標儀：北京普天新橋技術有限公司。電泳儀、電轉槽、化學發光顯色系統：美國BIO-RAD公司。

1.3模型制備及分組干預

參考K lein等文獻［8］所述，采用血管內穿刺的方法制作大鼠SAH模型。大鼠術前禁食水6 h，10%水合氯醛4 m l/kg常規麻醉，仰臥位固定大鼠，頸部剃毛，消毒鋪巾。沿頸部中線逐層剪開皮膚、皮下組織，顯露右頸總動脈分叉處。血管夾阻斷頸外動脈，于血管夾近端剪開頸外動脈，插入4-0單股尼龍線進入頸內動脈，從頸總動脈分叉部開始，刺入18～20 mm后感覺阻力存在，繼續插入約3mm，刺破大腦中動脈和大腦前動脈分叉處，停留穿刺線15 s后撤出，關閉縫合。

造模成功判定標準：剝離腦部時肉眼可見有血性液體散在分布于腦底基底池部位。

Sham組當穿刺線刺入感到阻力時退出，不刺破大腦前動脈與大腦中動脈分叉，其余操作均與SAH組相同。SAH+U0126組于造模前30m in經尾靜脈注射U0126 0.05mg/kg。Sham組和SAH組均注射等體積生理鹽水。SAH+DMSO組注射等體積的DMSO，注射體積為0.5m l/只。

1.4腦組織含水量測定

造模成功后24 h，隨機選取各組大鼠6只，以10%水合氯醛4m l/kg麻醉，迅速冰上斷頭取腦，迅速剝離雙側海馬組織（留做Western blotting檢測），取剩余大腦皮質200mg，精確到1mg的電子天平稱濕重后置于105℃恒溫干燥箱內干燥48 h至恒重，稱干重后按Elliot公式計算腦含水量。

1.5病理組織學檢查

每組取剩余6只大鼠，10%水合氯醛4m l/kg麻醉，4%多聚甲醛經左心室灌注固定后取腦，截取視交叉平面至大腦橫裂腦組織，常規石蠟包埋后連續冠狀切片，片厚5μm。分別取2張切片做HE染色。光學顯微鏡（400×）下觀察海馬CA1區神經元形態變化，每張切片取6個視野，Motic-6.0圖像采集及分析系統記錄高倍視野下存活與壞死神經細胞數量并計算均值。

1.6p-ERK、Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白免疫組化

每個因子分別取2張切片做免疫組織化學染色。切片常規脫蠟水化，3%過氧化氫去離子水孵育10 min，阻斷內源性過氧化氫酶，檸檬酸鹽高壓熱修復90 s，分別滴加兔抗p-ERK抗體（1∶400）、兔抗Beclin-1抗體（1∶200）、兔抗LC3-Ⅱ抗體（1∶300），濕盒中4℃過夜；滴加山羊抗兔二抗（PV60001），37℃孵育30 min，DAB顯色，脫水、透明、中性樹膠封片。PBS代替一抗陰性對照。鏡下觀察并攝片，每張切片在海馬CA1區隨機選取5個視野，運用Image Pro Plus6.0測量平均OD值，對結果進行半定量分析。

1.7Western blotting檢測

每組隨機選取6個上述檢測腦組織水含量分離出的海馬組織。RIPA裂解液加入PMSF及磷酸酶抑制劑，裂解勻漿組織，提取蛋白；以BSA為標準品進行蛋白濃度測定。20μl體系SDS-PAGE電泳，濕轉法轉移至PVDF膜上，10%脫脂牛奶室溫抗原封閉1 h。p-ERK一抗（1∶2000）、Beclin-1一抗（1∶1000）、LC3-Ⅱ一抗（1∶1000）孵育4℃過夜。TBST洗膜后，辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育1 h，洗膜后滴加ECL發光液，化學發光顯影，以Tublin和β-actin為內參，采用Quantity One軟件分別計算出p-ERK/Tublin、Beclin-1/β-actin、LC3-Ⅱ/β-actin相對灰度值。

1.8統計學分析

所有數據均采用Excel建立數據庫，SPSS 13.0統計分析軟件進行分析。所有計量資料均以（xˉ±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，采用SNK法進行組間兩兩比較。顯著性水平α=0.05。

2　結果

造模成功后大鼠精神萎靡，畏光，鼻腔、眼睛分泌物增多，進食進水量明顯減少，取材過程中發現基底池、大腦腳有明顯的血凝塊。實驗期間，手術過程中死亡4只大鼠，3只術后24 h之內死亡，另外2只大鼠取材過程中未發現明顯的血凝塊，共9只大鼠剔除實驗，均以備用大鼠補齊。

2.1腦組織含水量

與Sham組比較，SAH組腦組織含水量升高（P＜0.05）；與SAH組比較，SAH+DMSO組無顯著性差異（P＜0.05）；SAH+U0126組腦組織含水量升高（P＜0.05）。見表1。

表1　各組腦組織含水量比較（%）

2.2HE染色

Sham組大鼠海馬CA1區神經細胞結構正常，排列整齊，分為3～4層，胞核大而圓，核仁明顯。SAH組大鼠海馬區出現部分神經元失去正常形態，可見細胞間質水腫，神經元細胞核固縮、核深染，可見大量三角錐形的死亡神經細胞。SAH+U0126組可見大量變性壞死的神經細胞，神經細胞呈空泡狀或海綿狀，神經元細胞出現核固縮、碎裂和核仁消失現象。SAH+DMSO組細胞形態與SAH組類似。見圖1。

與Sham組相比，SAH組各時間點海馬CA1區神經元數量減少，死亡細胞數量增加（P＜0.05）；與SAH組相比，SAH+U0126組神經細胞數量減少，死亡細胞數量增加（P＜0.05）；SAH組與SAH+DMSO組無顯著性差異（P＞0.05）。見表2。

2.3p-ERK1/2的表達結果

p-ERK1/2在Sham組中有胞漿胞核弱表達，而在SAH組的胞漿胞核中有強陽性表達，染色呈棕黃色，陽性細胞數量較Sham組增多（P＜0.05）；SAH+U0126組染色較SAH組淺，陽性細胞數量減少（P＜0.05），而SAH+DMSO組與SAH組陽性細胞數量無顯著性差異（P＞0.05）。見圖2、表3。

圖1　各組大鼠海馬CA1區神經元細胞形態變化（HE染色，400×）

圖2　各組大鼠海馬CA1區神經元細胞ERK 1/2表達結果（免疫組織化學染色，400×）

表2　各組大鼠海馬CA1區神經元數量的比較

表3　各組大鼠海馬CA1區ERK 1/2免疫陽性細胞數量比較

Western blotting進一步定性分析顯示，與Sham組相比較，SAH組p-ERK1/2的表達明顯增高（P＜0.05），SAH+U0126組中p-ERK1/2的表達較SAH組有所降低（P＜0.05），而SAH+DMSO組與SAH組p-ERK1/2表達量無顯著性差異（P＞0.05）。見圖3、表5。

2.4Beclin-1及LC3-Ⅱ的表達結果

Beclin-1免疫組化染色呈棕黃色，主要表達在神經元細胞包漿中。Sham組偶見免疫陽性細胞，淡染，神經細胞排列整齊，結構正常，核仁明顯。與Sham組比較，SAH組細胞出現明顯損害，可見大量壞死神經元，染色均增強，免疫陽性細胞數均增加（P＜0.05）。與SAH組比較，SAH+U0126組神經細胞損害程度進一步加重，但其染色減弱，免疫陽性細胞數減少（P＜0.05）。SAH+DMSO組在染色深淺以及免疫陽性細胞數量方面與SAH組比較無顯著性差異（P＞0.05）。見圖4、表4。

圖3　各組大鼠海馬區p-ERK 1/2的Western blotting結果

LC3-Ⅱ在Sham組中有胞漿弱表達，而在SAH組的胞漿中有強陽性表達，染色呈棕黃色陽性細胞數量較Sham組增多（P＜0.05）。與SAH組比較，SAH+ U0126組神經細胞損害程度進一步加重，但其染色減弱，免疫陽性細胞數減少（P＜0.05）。SAH+DMSO組在染色深淺以及免疫陽性細胞數量與SAH組無顯著性差異（P＞0.05）。見圖5、表4。

Western blotting顯示，與Sham組相比較，SAH 組Beclin-1、LC3-II的表達增高（P＜0.05），SAH+ U0126組表達較SAH組有所降低（P＜0.05），而SAH+ DMSO組與SAH組表達無顯著性差異（P＞0.05）。見圖6、表5。

圖4　各組大鼠海馬CA1區神經元細胞Beclin-1表達結果（免疫組織化學染色，400×）

圖5　各組大鼠海馬CA1區神經元細胞LC3-Ⅱ表達結果（免疫組織化學染色，400×）

表4　各組大鼠海馬CA1區Beclin-1和LC3-Ⅱ免疫陽性細胞數量比較

表5　各組大鼠海馬區蛋白Western blotting定量結果（n=6）

圖6　各組海馬區Beclin-1和LC3-Ⅱ的Western blotting結果

3　討論

ERK是AMPK家族中的一類，其信號通路遵循AMPK信號轉導通路的三級激酶級聯反應，即Ras-Raf-MEK-ERK通路。細胞外刺激因子作用于細胞膜，激活受體酪氨酸酶或者G蛋白偶聯受體，逐級活化ERK信號通路，磷酸化的ERK進入細胞核，激活多種轉錄因子，產生效應蛋白發揮生物學效應［9］。

多種神經系統疾病均證實有ERK信號通路的激活。王耀岐等利用沙土鼠復制前腦缺血再灌注模型，發現海馬CA3區p-ERK表達明顯增高，而細胞凋亡明顯減少，表明腦缺血后可以通過ERK信號通路的激活減少神經細胞的凋亡，從而起到神經保護作用［10］。Wang等應用血管內穿刺的方法制造SAH大鼠模型，模型制造成功后立即給與右旋美托嘧啶，發現ERK磷酸化水平上調，腦水腫程度減輕，血腦屏障的通透性降低；而應用ERK通路抑制劑PD98095后，ERK磷酸化水平下調，神經功能損傷加重。提示ERK信號通路參與SAH后早期腦損傷階段的神經保護［11］。

本研究中選擇p-ERK作為ERK信號通路激活的指標，結果顯示，SAH模型大鼠p-ERK明顯升高，ERK信號通路激活，腦組織含水量明顯增加。而應用ERK信號通路抑制劑U0126處理后p-ERK的表達明顯下降，而腦組織含水量較模型組更為增加。提示抑制ERK信號通路可能導致SAH后早起腦損傷更為嚴重。但ERK是通過何種途徑參與的神經保護作用目前尚不明確。有研究顯示，在腦缺血再灌注動物模型中，ERK被激活，可明顯降低N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受體活性，并有效抑制了細胞內鈣離子的內流，從而起到神經保護作用［12］。也有研究顯示，在腦缺血再灌注模型中，ERK通路的激活可以激活神經細胞的自噬，抑制細胞凋亡，減少神經細胞丟失，從而起到神經保護作用。

自噬是細胞一種程序性死亡的方式，可以消化破壞衰老的細胞器，用以降解、回收、重新利用［13］。已有研究證實，腦神經細胞同樣存在自噬現象，并且適度的自噬有利于異常大分子及受損細胞器的清除，能夠提高神經細胞的存活率；相反過度的自噬則會誘導神經元死亡，對機體產生有害的作用［13-14］。LC3-Ⅱ及Beclin-1是檢測自噬必不可少的指標［15］。因此本實驗選用LC3-Ⅱ和Beclin-1作為檢測自噬水平的指標。相關文獻報道，SAH損傷后，24 h自噬的表達達高峰，48 h后恢復，因此本實驗選擇24 h為時間節點取材，進行蛋白水平的檢測。

本實驗結果顯示，SAH后LC3-II和Beclin-1的水平顯著升高，而U0126干預后其水平又明顯下降，提示SAH后神經細胞自噬可能是ERK通路依賴性的。SAH后損傷可能是通過ERK信號通路調節自噬參與細胞損傷與修復的調節。Zhao等應用雷帕霉素激活自噬，發現SAH大鼠皮質區LC3-Ⅱ及Beclin-1的表達增多，而皮質區神經元凋亡減少，腦水腫及血-腦屏障的破壞減輕，相反3-甲基腺嘌呤抑制自噬后，加重神經功能的損害［16］。Jing等認為自噬通路激活后抑制凋亡途徑，從而產生神經保護作用［17］。

本實驗病理學檢測及腦組織水含量的檢測結果顯示，SAH組海馬CA1區出現大量死亡的神經細胞，腦組織含水量增加；U0126干預后，海馬死亡神經細胞數量較SAH組更為明顯，腦組織含水量較SAH更大，提示抑制ERK信號通路可能使SAH后早期腦損傷階段神經損傷加重，ERK信號通路的激活可能參與神經細胞的保護。多項研究顯示p-ERK和Beclin-1表達呈平行關系，如Ni等應用MEK的特異性阻滯劑U0126干預可以降低細胞自噬的活化［18］。自噬是具有兩面性的病理生理過程，其在不同的機體環境以及不同的疾病狀態可能存在不同的作用，在大量SAH動物實驗早期腦損傷階段都傾向于適度的自噬具有神經保護作用。本實驗顯示，應用U0126抑制ERK信號通路后自噬水平下調，SAH后的早期腦損傷加重。

本實驗沒有涉及自噬的激活劑干預。后期我們會引入自噬及上游通路的激活劑進一步探討自噬在SAH早期腦損傷階段的作用。

綜上所述，本實驗結果顯示ERK信號通路參與SAH后早期腦損傷階段自噬水平的調節，其激活后可起到一定的神經保護作用。本實驗為SAH后的治療及藥物的開發提供了新思路。

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Effectof Extracellular Regulated Protein Kinases Signaling Pathway on Early Brain Injury and NeuronsAutophagy in Ratswith Subarachnoid Hemorrhage

LIU Jun-jie1，ZHAO Yɑ-ning1，LIU Ren-jie1，DING Jiɑ-shɑn1，CHEN Yu-ting1，XU Ji-wei1，LI Jiɑn-min2，TIAN Jing-rui3
1.North China University of Scienceand Technology，Tangshan，Hebei063000，China；2.Departmentof Neurosurgery，A ffiliated Hospitalof North China University of Science and Technology，Tangshan，Hebei063000，China；3.HebeiKey Laboratory for Chronic Diseases，Tangshan Key Laboratory for Preclinicaland Basic Research on Chronic Diseases，School of Basic Medical Sciences，North China University of Science and Technology，Tangshan，Hebei063000，China
Correspondence to LIJiɑn-min.E-mail：zyning789@126.com

Objective To explore the effectof extracellular regulated protein kinases（ERK）signaling pathway on early brain injury and autophagy of nerve cell in hippocampus area in ratswith subarachnoid hemorrhage（SAH）. Methods Forty-eightadultmale Sprague-Dawley ratswere random ly divided into sham group，SAH group，SAH+dimethylsulfoxide（DMSO）group and SAH+U0126 group，with 12 rats in each group.The SAH modelwas established with puncture of internal carotid artery.The SAH+U0126 group was injected with U0126 0.05mg/kg；the sham group and SAH group were injected with normalsaline，and the SAH+DMSO group was injected with DMSO 30m inutes beforemodeling.They were sacrificed 24 hours aftermodeling.The brain water contentwasmeasured with wetand drymethod.The morphology changes of neural cells in hippocampus CA1 were observed by HE staining.The expression of phosphorylation ERK（p-ERK），Beclin-1 and LC3-Ⅱwere detected with immunohistochemicalmethod and Western blotting.Results Compared with the sham group，the brain water content increased（P＜0.05），the number of survivalneurons decreased（P＜0.05），the expression of p-ERK，Beclin-1 and LC3-Ⅱincreased in SAH group（P＜0.05）.Compared with SAH group，the brain water content increased，the number of survivalneurons decreased （P＜0.05），the expression of p-ERK，Beclin-1 and LC3-Ⅱdecreased in SAH+U0126 group（P＜0.05）；and no significant difference was found in SAH+DMSO group（P＞0.05）.Conclusion The activation of ERK signaling pathwaymay alleviate early brain injury after SAH by regulation of autophagy.

subarachniod hemorrhage；early brain injury；autophagy；extracellular regulated protein kinases；rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2016.10.002

R743.3

A

1006-9771（2016）10-1121-06

1.河北省重大醫學課題（No.ZD2013093）；2.唐山市科技計劃項目（No.14130220B）；3.河北省大學生創新創業訓練計劃項目（No. 201610081029）。

1.華北理工大學，河北唐山市063000；2.華北理工大學附屬醫院神經外科，河北唐山市063000；3.華北理工大學基礎醫學院，河北省慢性疾病重點實驗室，唐山市慢性病臨床基礎研究重點實驗室，河北唐山市063000。作者簡介：劉俊杰（1990-），男，漢族，河北保定市人，碩士研究生，主要研究方向：腦損傷與腦保護。通訊作者：李建民，男，博士，主任醫師，主要研究方向：神經損傷與神經保護。E-mail：zyning789@126.com。

［本文著錄格式］劉俊杰，趙雅寧，劉仁杰，等.細胞外調節蛋白激酶信號通路對蛛網膜下腔出血大鼠神經元自噬及早期腦損傷的影響［J］.中國康復理論與實踐，2016，22（10）：1121-1126.

CITEDAS：Liu JJ，Zhao YN，Liu RJ，etal.Effectof extracellular regulated protein kinasessignaling pathway on early brain injury and neuronsautophagy in ratswith subarachnoid hemorrhage［J］.Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian，2016，22（10）：1121-1126.

蛛網膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage，SAH）是最常見的腦血管疾病之一，主要由動脈瘤破裂，動靜脈畸形出血等導致［1］。隨著影像技術、顯微神經外科技術、介入放射技術的發展，其病死率有所降低，但其發病率及致殘率仍較高［2］。目前臨床治療方法主要針對腦血管痙攣及再出血兩方面，并沒有改善患者的預后。近年來國外研究顯示，早期腦損傷（early brain injury）對患者的預后起決定性作用［3］，但其發生的機制尚未明確。早期腦損傷是指SAH發病后72 h內，全腦出現的整體性損傷，涉及所有病理、生理過程［4］。國外學者認為其發生機制可能有微循環障礙、炎性改變、神經細胞凋亡與自噬等［5］。

細胞外調節蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）是絲裂原活化蛋白激酶（m itogen-activated preteinkinases，MAPK）家族中的一類［6］。研究表明，ERK的異常激活不僅加重SAH后神經細胞的炎癥反應，還可以誘導神經細胞的自噬與凋亡［7］。但其在早期腦損傷階段激活的意義尚不明確。

本研究通過建立SAH大鼠模型，探討ERK信號通路對SAH后神經細胞自噬的調控作用及其意義，以探尋SAH后早期腦損傷的可能機制和治療SAH的新策略。

（2016-06-13

2016-07-19）