曲安奈德對棕色挪威大鼠脈絡膜新生血管生長的影響①

高小燕，何守志

曲安奈德對棕色挪威大鼠脈絡膜新生血管生長的影響①

高小燕，何守志

目的觀察光凝后即刻玻璃體腔內注射曲安奈德對棕色挪威大鼠脈絡膜新生血管生長的影響。方法36只健康棕色挪威大鼠隨機分為對照組和實驗組，每組18只，隨機抽取一眼作為實驗眼。建立棕色挪威大鼠脈絡膜新生血管動物模型。視網膜光凝后，實驗組立即玻璃體腔內注射曲安奈德8μl；對照組在實驗眼玻璃體內注射同等容積的等滲平衡鹽溶液。分別在光凝后2、4、6周取6只大鼠，采用免疫組化法檢測核因子-κB蛋白的表達，測量脈絡膜新生血管的最大面積。結果實驗組的脈絡膜新生血管面積及核因子-κB蛋白的表達低于同期對照組（t＞7.450，P＜0.001）。結論曲安奈德可抑制棕色挪威大鼠脈絡膜新生血管的生長，降低核因子-κB蛋白的表達。

曲安奈德；核因子-κB；脈絡膜新生血管；棕色挪威大鼠

［本文著錄格式］高小燕，何守志.曲安奈德對棕色挪威大鼠脈絡膜新生血管生長的影響［J］.中國康復理論與實踐，2016，22 （10）：1154-1158.

CITED AS：Gao XY，He SZ.Effects of triamcinolone acetonide on choroidal neovascularization in brown Norway rats［J］.Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian，2016，22（10）：1154-1158.

脈絡膜新生血管（choroidal neovascularization，CNV）可以導致嚴重的和永久的視力喪失，是現在眼科主要致盲的疾病之一。CNV現被廣泛地認為屬于創傷愈合和組織修復的幾個關鍵過程的一個組成成分［1］。CNV發展是一個復雜過程，包括各種細胞成分參與，以及細胞因子調節的失衡、轉錄因子的激活、趨化因子的表達等。在CNV的多種發病機制中，炎癥作用機制也日益引起人們的重視［2-3］。核因子-κB （nuclear factor-kappa B，NF-κB）是1986年從B細胞核中提取到的核轉錄因子，參與多種炎癥細胞因子及免疫基因表達的轉錄和調節。NF-κB在眼內新生血管中的研究較少，但已有體內外實驗陸續報道該因子參與誘導視網膜新生血管［4］。類固醇合成物是眾所周知的抗新生血管形成的藥物［5-7］。本實驗主要研究玻璃體內注射曲安奈德（triamcinolone acetonide，TA）對CNV的治療效果及機制，從而為指導臨床研究和治療CNV提供基礎理論依據。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1主要儀器與試劑

TA注射液（40 g/L），批號H53021604：昆明積大制藥有限公司。小鼠抗大鼠的NF-κB（MAB 0.1m l）：北京中杉金橋生物技術有限公司。即用型抗生蛋白鏈菌素生物素復合體（streptavidin-biotincomplex，SABC）試劑盒、0.01mol/L枸櫞酸鹽緩沖液：武漢博士德生物工程有限公司。3-氨基-9-乙基卡巴唑（3-am ino-9-ethylcarbozole，AEC）顯色試劑盒：北京中杉金橋生物技術有限公司。Novua 2000氪激光機：美國COHERENT公司。25μl微量進樣器：上海安亭微量進樣器廠。Image-ProPlus5.1圖像分析系統：美國MEDIA CYBERNETICS公司。

1.1.2實驗動物

36只健康雄性清潔級棕色挪威（brown Norway，BN）大鼠，中國醫學科學院實驗動物中心提供，體質量200～220 g。動物的使用和管理遵循國家科學技術部頒布的《實驗動物管理條例》。

1.2方法

1.2.1CNV模型的建立及動物分組

檢查所有大鼠雙眼前節和眼底，均正常，按照隨機數字表法分為實驗組和對照組，每組實驗動物隨機分為2、4、6周組，每小組6只。選取一眼作為激光光凝眼，另一眼為不光凝正常眼。參照本實驗室CNV造模方法［8］，采用氪激光（647 nm）距視盤等距離圍繞視盤光凝大鼠視網膜。激光參數：功率360mW，光斑直徑100μm，曝光時間0.05 s。

1.2.2藥物的應用

實驗組全麻狀態下，1%丁卡因滴眼液表面麻醉后，手術顯微鏡下，30G針頭顳側角膜緣后0.5mm作一穿刺口，微量注射器從穿刺口進針，約1.5mm深，針尖朝向視神經方向，玻璃體中可見針尖，緩緩注入TA 8μl（320μg）。由散大的瞳孔可觀察到玻璃體中TA的白色混懸液體。輕輕拔針后，顯微鑷子輕夾穿刺口片刻，以利穿刺口閉合。

對照組玻璃體內注射同樣容積的等滲平衡鹽溶液（balanced salt solution，BSS）。因注射造成晶體損傷的眼均被排除實驗。

1.2.3組織病理學檢查

分別在2周、4周、6周時，深度麻醉下摘除6只大鼠的眼球，蒸餾水沖洗，置于40 g/L多聚甲醛液中固定2 h。按病理組織學方法梯度酒精脫水、透明、浸蠟、包埋，蠟塊4℃保存備用。眼球組織5μm厚度連續切片，置于50℃的蒸餾水中展片，撈片，置烤箱37℃烤片12 h后，4℃保存。常規脫蠟，行HE染色。光學顯微鏡下觀察并拍照。采用Image-Pro Plus 5.1圖像分析軟件計算400倍光學顯微鏡下CNV面積。選取每個眼球連續切片中含有最大CNV直徑的切片，每個標本測量5張切片，取其平均值。

1.2.4免疫組織化學法

石蠟切片常規脫蠟至水；3%H2O2室溫孵育10 m in，阻斷內源性過氧化物酶活性，蒸餾水沖洗，PBS浸泡5m in；切片置于盛有0.01mol/L枸櫞酸鹽緩沖液的抗原修復盒中，微波中火加熱15min進行抗原微波爐熱修復；滴加封閉用正常山羊血清工作液，室溫孵育15m in；滴加小鼠抗大鼠的NF-κB單克隆抗體（1∶70），4℃過夜，0.01mol/L PBS洗滌；滴加生物素標記山羊抗小鼠IgG，室溫孵育15m in，0.01mol/L PBS洗滌；滴加辣根酶標記鏈酶卵白素工作液，37℃孵育40m in，0.01mol/L PBS洗滌；滴加AEC，室溫顯色，鏡下控制反應時間3～10m in，蒸餾水充分洗滌；蘇木素輕度襯染10 s，自來水充分水洗，水溶性封片劑封片。用0.01mol/L的PBS取代一抗孵育，作為陰性對照，以試劑盒提供的大鼠肺腫瘤組織切片作為陽性對照。切片內被染成紅色的點、團簇為陽性反應物。

1.3圖像分析與數據處理

采用Image-Pro Plus 5.1圖像分析軟件計算400倍光學顯微鏡下陽性染色區域積分光密度值（integrated optical density，IOD），選取每個眼球連續切片中含有最大CNV直徑的切片，每個標本測量5張切片，取其平均值。

1.4統計學分析

采用SPSS 13.0統計學軟件進行統計分析。本研究測量指標的數據資料經Shapiro-Wilk檢驗證實呈正態分布，以（xˉ±s）表示。組間均數經Levene檢驗方差齊。采用完全隨機分組單因素干預多水平實驗設計；組內光凝后不同時間組大鼠CNV面積、NF-κB蛋白表達差異用單因素方差分析；兩兩比較用SNK檢驗；同一時間內的組間比較用Student t檢驗。顯著性水平α=0.05。

2　結果

光凝后6周內，對照組病理組織切片有清晰的新生血管形成，CNV隨時間增厚，CNV中包含膠原組織和管腔中含有紅細胞的增殖的血管，炎性細胞主要是巨噬細胞的浸潤。實驗組CNV隨時間呈逐漸增加的趨勢，但纖維血管膜增殖形成不明顯（圖1）。可見光凝處視網膜外層斷裂，視網膜色素上皮（retinal pigmentepithelium，RPE）和Bruch膜的缺失，少量的紅細胞、炎性細胞浸潤在激光斑處，在RPE和Bruch膜的缺失處可見到明顯的鞏膜。

兩組CNV面積均隨著時間顯著增加（P＜0.001），實驗組顯著小于對照組（P＜0.001）。兩組NF-κB蛋白表達均隨時間顯著升高（P＜0.001），實驗組顯著低于對照組（P＜0.001）。見表1、表2、圖1、圖2。

表1　兩組CNV面積比較（μm2）

表2　兩組NF-κB表達（IOD）

圖1　兩組CNV面積的變化（HE染色，400×）

圖2　兩組NF-κB蛋白表達（免疫組織化學染色，400×）

3　討論

CNV是許多脈絡膜視網膜疾病的最終結局，可導致不可逆性的中心視力損害。治療CNV的關鍵在于阻斷其發展過程，而藥物治療是最有希望阻斷病變發展進程的方法之一［9-12］。早期使用抗血管生成藥物來控制CNV的發生、發展逐漸受到重視，皮質類固醇就是其中之一。近期，人們開始關注采用TA玻璃體腔注射治療眼內新生血管［13-15］。已有大量臨床或實驗研究發現TA可抑制視網膜CNV形成［16-18］，但其可能機制還未知。

本實驗研究發現，光凝后即刻玻璃體腔內注射TA 8μl可以顯著抑制新生血管形成和發展。

最近，有臨床資料證實玻璃體腔內注射TA 25mg可以抑制年齡相關性黃斑變性（age-relatedmacular degeneration，ARMD）患者的新生血管［19-20］，但TA治療CNV的機制還未知。我們通過免疫組化方法發現，在CNV生長的6周內，NF-κB的表達也逐漸增強。NF-κB作為轉錄調控細胞因子，可能通過多種不同的機制參與CNV的生長發展，通過上調其他細胞因子的表達，起始和促進CNV的生長。有學者發現NF-κB的活化在激光誘導的CNV模型中起到致炎與致新生血管形成的作用［21］。亦有學者在激光誘導的CNV模型中，發現NF-κB的活化可以通過上調基質金屬蛋白酶-2（matrixmetallopeptidase-2，MMP-2）表達而促進新生血管形成［22］。已知很多細胞因子的啟動子區含有NF-κB的結合位點或識別位點［23］，而糖皮質激素是NF-κB的抑制劑［24-25］。本研究顯示，TA可以降低棕色挪威大鼠激光斑損傷區中NF-κB的活性，從而影響CNV的生長。

有臨床研究表明，TA除抑制新生血管的生長外，還能夠改善視力。盡管TA玻璃體內注射在某些方面還存在一些爭議，但是對于許多難治性的眼底疾病，如黃斑下CNV、復發性CNV，已顯示出一定的優越性［26］。有學者發現N-乙酰半胱氨酸（N-acetyl-cysteine，NAC）可以抑制激光誘導的CNV中NF-κB的活化，從而抑制CNV形成［27］。我們發現，在棕色挪威大鼠CNV模型中激光光凝后即刻玻璃體腔內注射TA，可降低NF-κB的蛋白表達，抑制CNV生長。TA是阻斷CNV病程發展的理想藥物，并且可能是通過降低NF-κB活性而發揮作用。

本實驗僅在光凝后即刻玻璃體內注射TA來干預CNV形成，對于CNV形成之后，TA對CNV的作用尚需要進一步研究。

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Effectsof Triam cinoloneAcetonide on ChoroidalNeovascularization in Brown Norway Rats

GAO Xiɑo-yɑn，HEShou-zhi
1.Department of Ophthalmology，North China University of Technology Community Health Service Center，Beijing 100144，China；2.Departmentof Ophthalmology，General Hospital of PLA，PLA Eye Center，Beijing 100853，China
Correspondence to GAO Xiɑo-yɑn.E-mail：gaoxy76@sina.com

Objective To observe the effect of intravitreal triamcinolone acetonide injection on choroidal neovascularization in brown Norway rats. Methods Thirty-six healthy brown Norway ratswere divided random ly into controlgroup（n=18）and experimental group（n= 18），while one eyewas chosen random ly asexperimentaleye.The choroidalneovascularizationmodelwasestablishied，while 8μl triamcinolone acetonidewas injected in vitreous body immediately after photocoagulation in the experimental group，and the same volume isotonic balanced salt solution was injected in the controlgroup.The eyes of six ratswere enucleated for histological slices in the second，forth，and sixth week，respectively.The expression of nuclear factor-kappa B was detected with immunohistochem icalmethod，and themax area of choroidalneovascularization was alsomeasured.Results The area of choroidalneovascularization was smaller，and the expression of nuclear factor-kappa B was lower in the experimental group than in the control group（t＞7.450，P＜0.001）.Conclusion Triamcinolone acetonide could effectively inhibit the development of choroidal neovascularization，and decrease the expression of nuclear factor-kappa B in brown Norway rats.

triamcinolone acetonide；nuclear factor-kappa B；choroidalneovascularization；brown Norway rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2016.10.009

R773.4

A

1006-9771（2016）10-1154-05

1.北方工業大學社區衛生服務中心眼科，北京市100144；2.中國人民解放軍總醫院眼科，全軍眼科中心，北京市100853。作者簡介：高小燕（1976-），女，山東青島市人，漢族，博士，副主任醫師，主要研究方向：眼底病。E-mail：gaoxy76@sina.com。

（2016-04-22

2016-06-03）