苜蓿植株及根際土壤中主要酚酸和香豆素物質含量測定①

榮思川，師尚禮*，孫燦燦

（1 甘肅農業大學草業學院，蘭州 730070；2 草業生態系統教育部重點實驗室，甘肅省草業工程實驗室，中-美草地畜牧業可持續研究中心，蘭州 730070）

苜蓿植株及根際土壤中主要酚酸和香豆素物質含量測定①

榮思川1，2，師尚禮1，2*，孫燦燦1

（1 甘肅農業大學草業學院，蘭州 730070；2 草業生態系統教育部重點實驗室，甘肅省草業工程實驗室，中-美草地畜牧業可持續研究中心，蘭州 730070）

通過高效液相色譜（HPLC）法測定不同試驗地間18個苜蓿（Medicago sativa L.）品種植株及根際土壤中主要酚酸和香豆素物質的含量，分析其在不同品種苜蓿植株中的分布特征及不同試驗地間差異。經過ASE 350型加速溶劑萃取儀萃取苜蓿植株及根際土壤中酚酸類和香豆素物質，萃取液存放于2oC冰箱，并用0.45 μm有機濾膜過濾后通過HPLC測定自毒物質含量。結果顯示，18個苜蓿品種中香豆素、阿魏酸、綠原酸、咖啡酸的含量存在差異，其中香豆素、綠原酸含量顯著高于阿魏酸、咖啡酸含量。各苜蓿品種間單一自毒物質含量差異顯著（P＜0.05），香豆素、阿魏酸、綠原酸和咖啡酸的總含量差異明顯。武威試驗地酚酸和香豆素物質平均含量比會寧試驗地低4.01%。研究表明：不同苜蓿品種間香豆素、阿魏酸、綠原酸、咖啡酸物質總含量差異顯著；苜蓿植株中香豆素、阿魏酸、綠原酸、咖啡酸物質總含量與根際土壤中含量差異極顯著。

加速溶劑萃取法；HPLC；紫花苜蓿；香豆素；酚酸

紫花苜蓿（Medicago sativa L.）在種植4年以上會出現田間密度下降幅度較大、草地生產力也急劇下降的現象，并且補種和修復也鮮有成功［1-3］。研究證實，造成這種現象的主要原因是苜蓿自毒性作用［4-6］。苜蓿自毒性是一種特殊的種內化感作用，即一個種的苜蓿植株產生的某些次生代謝物通過揮發、淋溶和分泌等方式對周圍苜蓿植株產生有益或有害的影響［7-8］。通常這些物質會從莖、葉、根部和種子等器官釋放到周圍環境中來影響幼苗的根系統，主要表現為抑制幼苗胚軸細胞伸長和胚根生長、幼苗根系統中某些酶的活性，進而抑制了苜蓿根部對水分的吸收［9-11］。許多研究發現，自毒物質并不是某單一物質，而是多種物質的混合物，且自毒效應是多種物質的綜合作用［12］。自紫花苜蓿中三十烷醇對其他作物具有刺激作用的文章發表后，關于苜蓿自毒物質的相關研究便在各學術雜志上陸續報道。Wyman-Simpson 等［13］研究發現，苜蓿中普遍存在苜蓿酸大豆皂苷B（soyasapogenol glycoside B），且隨著濃度的增大，其化感抑制作用越強。Birkett等［14］認為苜蓿皂苷（medicagenic acid glycosides）是苜蓿化感作用的主要物質。但Miller［15］認為苜蓿皂苷并不是苜蓿自毒物質，對苜蓿自身不能造成傷害。而后Miller［16］采用外源添加試驗的方法驗證了苜蓿素（medicarpin）和異黃酮類（isoflavonoid）對苜蓿種子發芽的毒害作用，使發芽率降低至41%。Abdul-Rahman和Habib［17］研究發現苜蓿植株可以釋放綠原酸（chlorogenic acid）、阿魏酸（ferulic acid）、對羥基苯甲酸（p-hydroxybenzoic acid）、咖啡酸（caffeic acid）等酚酸類物質。Hall和Henderlong［12］、李占玉等［18］也有關于酚酸類物質自毒性的研究報道。Chung等［19］研究苜蓿植株浸提液中酚酸含量及化感效應，發現綠原酸與苜蓿自毒性密切相關，且自毒效應與浸提液濃度呈正相關。隨著研究的深入，越來越多的自毒物質被研究者發現并證明了其自毒性，如Miersch和Jiihlke［20］研究發現苜蓿刀豆氨酸也具有自毒效應，含量高于1% 時，其自毒效應較強；低于某濃度時，反而有促進作用。盧成等［21］、李志華等［22］利用液相色譜方法測定苜蓿中酚酸類、香豆酸、香豆素等自毒物質的含量，測定結果顯示香豆素、咖啡酸的含量較高。卜偉等［23］、唐玲麗等［24］利用高效液相色譜法測定土壤中有機物質含量。近年來國內雖有報道關于檢測苜蓿植株中自毒物質含量的研究，但總體上對于苜蓿自毒物質含量測定方法方面的研究仍然十分稀少，因此本研究是在總結前人研究的基礎上，進一步對不同品種苜蓿植株、根際土壤中自毒物質含量的測定，對于更深入地了解苜蓿自毒效應和苜蓿連作障礙提供依據。

1 材料與方法

1.1 采樣地概況

試驗材料采樣地分別位于甘肅省武威市黃羊鎮（37°55′N，102°40′E，海拔1 530 m，氣候類型屬于溫帶干旱荒漠氣候，年平均溫度7.2℃，年降水量150 mm左右，年蒸發量約2 010 mm，無霜期154 天，土壤類型為灌淤土，具備灌溉條件）和甘肅省會寧縣（35°72′N，105°08′E，平均海拔2 025 m，年均降水量332.6 mm，年均氣溫7.9℃，年均無霜期155 天，屬于中溫帶半干旱氣候，土壤類型為灰鈣土，很少具備灌溉條件）。

于2011年4月10日播種，試驗小區采用完全隨機區組設計，每個小區面積5 m × 3 m，每個品種4次重復，小區間隔0.5 m。采用條播方式，行距0.4 m，小區間走道1 m，試驗地周邊1.5 m保護行。

1.2 材料與試劑

供試材料編號A ～ F是取自甘肅省會寧縣樣地，G ～ R是取自甘肅省武威市黃羊鎮樣地。苜蓿材料品種及來源見表 1。試驗中用到的主要試劑：阿魏酸（純度≥99.0%），咖啡酸（純度≥98.0%），綠原酸（純度≥95.0%），香豆素（純度≥99.0%），均購自美國Sigma公司；甲醇（色譜純），德國CNW Technologies 有限公司；乙酸（分析純），國藥集團化學試劑有限公司；其他試劑均為分析純。

表1 供試材料及其來源Table1 Tested materials and their sources

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品前處理 浸提液提取材料（苜蓿植株及根際土壤）在2015年5月20日即在苜蓿第一茬分枝期（4年齡苜蓿）時刈割采集樣本，自封袋收集帶回實驗室。采集的苜蓿植株，先晾曬48 h，然后37℃條件下烘干，粉碎機粉碎后收集，2℃ 儲存備用；根際土壤采用抖落法［25-26］收集，采用自然風干的方法風干后，過直徑2 mm篩子，存放于2℃冰箱中。天平準確稱取18個苜蓿品種的植株（5.00 g）和根際土壤（20.00 g）樣放于萃取池（內口徑2.7 cm × 5.2 cm）中，放于ASE 350型加速溶劑萃取儀中萃取。首先對樣品的萃取條件進行優化，選擇的萃取溶劑為80% 甲醇，萃取爐的溫度調整為50℃，熱平衡時間和靜態萃取時間均為5 min，溶劑流速為2.5 ml/min，氮氣吹掃時間為120 s，循環2次，最終萃取液總體積為30.0 ml。萃取液保存在2℃冰箱備用，測定前過0.45 μm有機濾膜。

1.3.2 標準溶液的配制 準確稱取香豆素、阿魏酸、綠原酸、咖啡酸4種物質標準品各10.00 mg 于100.00 ml 容量瓶中，分別用50% 甲醇（色譜級）溶解并定容至刻度，配制成 100 mg/L的標準品母液，存放于棕色試劑瓶中，-20℃ 保存備用。上液相色譜儀前，用甲醇溶液采用逐級稀釋法將標準品母液配制成一系列濃度的標準品混合溶液（2、5、10、20、40和80 mg/L）。

1.4 儀器與設備

Thermo Fisher ASE 350型加速溶劑萃取儀，美國Thermo Scientific 公司；Agilent 1260 Infinity HPLC液相色譜儀，美國Agilent公司；ELGA超純水儀ULTRA，英國ELGA公司；SCALTEC電子天平（SBC 22，當量0.01 mg），德國SCALTEC公司；Spectrum SP-756P型分光光度計，美國RGB Spectrum公司；0.45 μm有機相針式濾器，上海安譜科學儀器有限公司。

1.5 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse plus C18分析柱（4.6 mm × 150 mm，3.0 μm）；流動相：0.3%乙酸水溶液（A）和甲醇（B），梯度洗脫，洗脫程序見表2；流速：0.50 ml/min；柱溫：35℃；進樣量為10.0 μl；波長掃描范圍 190 ～ 400 nm，定量檢測波長為320 nm。

表2 流動相配比與洗脫時間Table2 Gradient phase and elution time

1.6 數據處理與分析

采用Excel 2010和SPSS 19.0軟件對數據進行處理與分析。

2 結果與分析

2.1 標準品液相色譜圖

ASE 350型加速溶劑萃取儀制得苜蓿植株浸提液和根際土壤浸提液，0.45 μm有機濾膜過濾后用HPLC儀，采用表 2 中的方法定量檢測18個苜蓿品種植株及根際土壤中4種自毒物質（香豆素、阿魏酸、綠原酸、咖啡酸）的含量。通過上述方法和條件測得 4種自毒物質標準品色譜圖（圖1）。

2.2 苜蓿植株中自毒物質含量分析

苜蓿植物中自毒物質高效液相色譜見圖2。圖中顯示，4種自毒物質（綠原酸、咖啡酸、阿魏酸和香豆素）能夠完全分離，說明1.5中色譜條件能夠達到分離、測定這4種自毒物質的目的，且4種物質定量檢測形成的色譜峰峰型良好，沒有干擾峰。

由表 3 可知，經過HPLC定量測定并與標準品對照后，18個苜蓿品種植株中4種自毒物質（香豆素、阿魏酸、綠原酸、咖啡酸）的含量存在差異。其中4種自毒物質總含量最高的品種是H，總含量最低的品種為K，18個品種平均總含量為462.61 mg/kg，其中K品種4種自毒物質總含量僅為H品種的41.7%。其余單一自毒物質含量差異性分析如下。HPLC測定18個苜蓿品種中香豆素含量最高的是O，含量最低的為Q，Q品種含量僅為O品種的9.64%，18個品種平均含量為183.57 mg/kg，各苜蓿品種間香豆素含量差異均顯著（P＜0.05）。阿魏酸含量最高的品種是N，含量最低的品種為D，D品種含量僅為N品種的15.98%，各品種平均含量為0.83 mg/kg，且各品種間阿魏酸含量差異僅有I和Q，E和F，C和D之間差異不顯著，其余品種間差異均顯著（P＜0.05）。對于綠原酸，含量最高的品種為D，含量最低的品種為K，K品種含量僅為D品種的24.11%，18個品種平均含量273.36 mg/kg，各品種間綠原酸含量除了D和R，G、J和L，H和N，A和O，C和F，E、M和Q之間差異不顯著外，其余品種間含量差異均顯著（P＜0.05）。咖啡酸含量最高的苜蓿品種為N，含量最低的為C品種，C品種含量僅為N品種的2.66%，18個品種平均含量為4.45 mg/kg；且各品種間含量差異均顯著（P＜0.05）。

圖1 4種自毒物質標準品混合溶液高效液相色譜圖（320 nm）Fig. 1 HPLC Chromatogram of the standards mixing solution containing 4 autotoxins at 320 nm

圖2 樣品液相色譜圖 （320 nm）Fig. 2 HPLC Chromatogram of a sample at 320 nm

表3 苜蓿植株中自毒物質的含量Table3 Autotoxins contents in alfalfa plant

2.3 根際土壤中自毒物質含量分析

由表 4 可知，18個苜蓿品種根際土壤中4種自毒物質含量也存在差異。其中根際土壤中自毒物質總含量最高的品種是A，而含量最低的為L品種，18個品種平均總含量為12.33 mg/kg，其中L品種4種自毒物質總含量僅為A品種的33.3%。

表4 苜蓿根際土壤中自毒物質含量Table4 Autotoxins contents in alfalfa rhizosphere soil

表4中還顯示，各種自毒物質的含量差異顯著。如香豆素的含量，最高的為A品種，含量最低的為L品種，L品種含量僅為A品種的21.31%，18個品種平均含量為4.61 mg/kg，除了I和P品種，B和J品種，H和O品種，C、K、F和R，D和G品種含量差異不顯著外，其余品種之間含量差異均顯著（P＜0.05）。阿魏酸含量最高的品種為B，最低的為I品種，I品種含量僅為B品種的6.17%，平均含量為0.59 mg/kg，除了C、E、H和Q，J和R，K、M和R，D和F，D和N，G和L，A和I品種差異不顯著外，其余品種之間差異均顯著（P＜0.05）。對于綠原酸，18個品種中含量最高的品種為A，含量最低的為G，G品種含量僅為A品種的32.99%，平均含量為5.34 mg/kg，除了I和P，B、J和Q，H和O，E和H，E和M，D和G，L和N含量差異不顯著外，其余品種間含量差異均顯著（P＜0.05）。咖啡酸含量最高的為R，最低的為J，J品種含量僅為R的42.91%，平均含量為1.79 mg/kg，其差異除了F和R，C和K，A、I和P，B和O，D、E、G、H、L、M和N不顯著外，其余品種間差異均顯著（P＜0.05）。

2.4 苜蓿植株與根際土壤中自毒物質含量比較

由表3和表4可知，18個苜蓿品種植株中4種自毒物質（香豆素、阿魏酸、綠原酸和咖啡酸）平均總含量為462.61 mg/kg，根際土壤中平均總含量為12.33 mg/kg，根際土壤中含量僅為苜蓿植株中的2.67%。單一自毒物質含量方面，18個苜蓿品種植株中香豆素、阿魏酸、綠原酸、咖啡酸的平均含量分別為183.57、0.83、273.76和4.45 mg/kg，根際土壤中4種物質平均含量分別為4.61、0.59、5.34和1.79 mg/kg，4種物質在根際土壤中含量分別為苜蓿植株中含量的2.51%、71.08%、1.95% 和40.22%。上述數據顯示，苜蓿植株中自毒物質總含量遠高于根際土壤中含量，苜蓿植株中單一自毒物質含量也顯著高于根際土壤中含量。

2.5 采樣地差異比較

對兩個采樣地之間比較發現，黃羊鎮采樣地苜蓿品種自毒物質總含量的平均值為469.32 mg/kg，比會寧縣采樣地（平均值488.95 mg/kg）低了4.01%。各單一自毒物質兩個樣地間比較，會寧樣地阿魏酸、咖啡酸、綠原酸和香豆素含量分別為1.13、4.90、289.52和180.81 mg/kg，黃羊鎮樣地4種物質含量分別為0.78、4.22、265.88 和184.95 mg/kg，數據顯示會寧樣地阿魏酸、咖啡酸和綠原酸含量分別比威武樣地高30.97%、13.88% 和8.17%，而香豆素含量卻低2.29%。

2.6 18個苜蓿品種聚類分析

根據18個苜蓿品種間4種自毒物質含量差異進行Pearson聚類分析。由圖 3 知，以香豆素、綠原酸、咖啡酸、阿魏酸及4種物質總含量作為聚類變量，將18個苜蓿品種分成4 大類。由右向左第一個豎箭頭線處，將其分成4大類，第一類為Q，第二類為I和K，第三類為O，其余為第四類。第二個豎箭頭處，可將18個苜蓿品種進一步分成7小類，即E、F、C、P、D、J、A、R、L、M為第一小類，B為第二小類，H為第三小類，G和N為第四小類，O為第五小類，I和K為第六小類，Q為第七小類。

圖3 18個苜蓿品種自毒物質含量的聚類分析圖Fig. 3 The clustering analysis diagram of autotoxins in 18 alfalfa varieties

3 討論

對18個苜蓿品種分枝期的植株及根際土壤浸提液中4種自毒物質（香豆素、阿魏酸、綠原酸、咖啡酸）含量進行HPLC檢測和分析后，發現不同品種間苜蓿植株和根際土壤中4種自毒物質含量存在差異，即自毒物質含量因品種不同而存在差異，這與多數研究結果一致［21-22，27-28］。通過聚類分析后，發現苜蓿品種間自毒物質含量差異大小不一，可將自毒物質含量相近或差異較小的品種歸為一類，方便直觀地表述自毒物質分布特征在品種間的相似程度。

鄭潔等［29］利用超高液相色譜法同時測定柑橘中主要酚酸和類黃酮物質的含量，建立了快速檢測柑橘中這些物質的方法。張娜等［30］利用UPLC-MS法測稻米中酚酸化合物組分及含量，快速、準確地檢測出稻米中酚酸化合物含量，并對其他谷物中酚酸化合物含量測定及HPLC法檢測苜蓿植株及根際土壤中酚酸類及其他自毒物質含量測定提供了參考。鄔彩霞等［31］研究黃花草木犀水浸提液中化感物質的分離與鑒定，檢測到香豆素含量最高，且對黑麥草的抑制作用明顯，推測香豆素是黃花草木樨水提液中主要化感物質，這也為本研究中4種自毒物質的篩選提供了理論支持。周凱等［32］研究菊花不同部位及根際土壤水浸提液處理對光合作用的自毒效應，發現浸提液可抑制菊花葉片光合、呼吸速率，對葉片葉綠素含量也有抑制作用，尤其菊花地上部分水浸提液的抑制作用顯著，這也間接地說明植株地上部分自毒物質含量要高于地下部分，而根際土壤中的自毒物質主要來源尚不清楚，這也是本研究想要探討的問題。董曉寧等［33］研究多年生黑麥草的化感物質（GC-MS鑒定）及其抑草潛力，發現與抑制作用關系密切的物質主要為苯酚類和酸類物質。張文明等［34］關于連作馬鈴薯根系分泌物成分及其自毒效應的研究，表明棕櫚酸和鄰苯二甲酸二丁酯是馬鈴薯根系分泌的主要自毒物質。胡遠彬等［35］研究黃芪水浸提液化感作用，發現“低促高抑”的化感作用特點。肖靖秀等［36］研究間作小麥蠶豆不同生長期根際有機酸和酚酸變化發現不同生長期的有機酸和酚酸含量存在差異。以上研究可見自毒物質種類繁多，不同種的植物其自毒物質的種類及其含量均存在差異，而自毒物質對于植物的影響也是多方面的，包括生理［32，34］、表型性狀［31，33］等。

本研究通過HPLC測定苜蓿植株及根際土壤中4種自毒物質含量，發現苜蓿植株中總含量顯著高于根際土壤，以R品種為例，根際土壤中總含量僅為植株總含量的2.1%。研究結果也發現部分品種單一自毒物質在苜蓿植株中含量低于根際土壤。如阿魏酸，G品種植株中含量為0.56 mg/kg，而根際土壤中含量為0.74 mg/kg，可見根際土壤中自毒物質含量不僅來源于苜蓿植株（葉和莖），還來源于根部，這與Staman等［37］、Sene等［38］、Seal等［39］的研究結論相一致。另外，4種自毒物質的自毒性強弱比較，還需要采用外源添加試驗來探討。

比較兩個采樣地自毒物質平均含量（A ～ F品種取自甘肅省會寧縣樣地，G ～ R品種取自甘肅省武威市黃羊鎮樣地），發現會寧采樣地苜蓿中自毒物質總含量平均值高于黃羊鎮樣地。除了香豆素外，其余單一自毒物質含量會寧樣地均大于黃羊鎮樣地，比較兩個樣地自然條件、土壤類型和灌溉條件后，可能有以下原因：①會寧樣地不具備灌溉條件而黃羊鎮樣地具備，黃羊鎮樣地進入土壤中的自毒物質會因澆灌水的沖刷滲透作用將自毒物質帶入地下深處，而采集的土樣多在地表層（0 ～ 20 cm），所以HPLC測定量較小；②會寧樣地土壤為灰鈣土，是一種弱淋溶干旱土，而黃羊鎮樣地為灌淤土且疏松多孔、淋溶系數大，因此通過淋溶的方式將自毒物質轉移至土壤下層，因此黃羊鎮樣地HPLC測定量較小。

4 結論

18個苜蓿品種中4種自毒物質（香豆素、阿魏酸、綠原酸、咖啡酸）含量存在顯著差異。4種自毒物質在苜蓿植株中總含量遠高于根際土壤，但部分品種根際土壤中某單一自毒物質（如阿魏酸）含量高于植株中含量。

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Determination of Coumarins and Major Phenolic Acids in Plant and Rhizosphere Soil of Alfalfa （Medicago sativa L.）

RONG Sichuan1，2， SHI Shangli1，2*， SUN Cancan1
（1 College of Grassland Science， Gansu Agricultural University， Lanzhou 730070， China； 2 Key Laboratory of Ecosystem of Ministry of Education， Pratacultural Engineering Laboratory of Gansu Province， Sino-US Center for Grazingland Ecosystem Sustainability， Lanzhou 730070， China）

To find out the distribution characteristics of major phenolic acids and coumarins in 18 alfalfa （Medicago sativa L.） varieties from different testing fields， the contents of these substances in plant and rhizosphere soil were determined by HPLC method. The coumarins and major phenolic acids in plant and rhizosphere soil were extracted using ASE 350 accelerated solvent extractor， and the extracts were stored at 2℃. After filtered through 0.45 μm organic filtration membrane， the autotoxins contents in the extracts were determined by HPLC. Results showed that the contents of coumarin， ferulic acid， chlorogenic acid and caffeic acid in 18 alfalfa varieties varied with plant varieties. Among these substances， the contents of coumarin and chlorogenic acid were dramatically higher than those of ferulic acid and caffeic acid. The differences of single autotoxin content among varieties were significant （P＜0.05）， and total contents of coumarin， ferulic acid， chlorogenic acid and caffeic acid varied with plant varieties as well. In addition， the average contents of phenolic acids and coumarins from Huining testing field were 4.01% higher than these from Wuwei testing field. In conclusion， the total contents of coumarin， ferulic acid， chlorogenic acid and caffeic acid were significantly different among various alfalfa varieties （P＜0.05）， and the total contents of these substances in alfalfa plant were remarkably different from those in rhizosphere soils.

Accelerated solvent extraction （ASE）； HPLC； Medicago sativa L.； Coumarins； Phenolic acids

S326

10.13758/j.cnki.tr.2016.05.014

國家現代牧草產業技術體系建設專項（CARA-35）和全國牧草種質資源保種項目（NB2130135）資助。

*通訊作者（shishl@gsau.edu.cn）

榮思川（1987— ），男，山東單縣人，碩士研究生，主要從事牧草種質資源及育種研究。E-mail： rongsc100@126.com