混合菌群強化去除泥漿體系中菲、芘的效果及影響因素①

劉一凡，宗良綱，史艷芙，孫明明，杜霞飛

（南京農業大學資源與環境科學學院，南京 210095）

混合菌群強化去除泥漿體系中菲、芘的效果及影響因素①

劉一凡，宗良綱*，史艷芙，孫明明，杜霞飛

（南京農業大學資源與環境科學學院，南京 210095）

通過室內泥漿體系模擬試驗，研究了混合微生物菌群（嗜熱菌和多環芳烴特異性降解菌），在40℃條件下（兩類微生物均能較快生長繁殖），對泥漿體系中代表性多環芳烴菲、芘的去除效果及其影響因素（水土比，葡萄糖、淀粉、水楊酸及其濃度）。結果表明：泥漿體系中混合微生物菌群對多環芳烴的去除效果顯著（P＜0.01），單日菲去除率最大可達20.0%，芘達15.3%。隨著反應進程的進行，菲和芘的去除率提高，去除速率則逐步降低，菲的半衰期1.8 天小于芘4.9 天，因此菲的去除較芘更快。試驗得到該泥漿體系中混合微生物菌群去除多環芳烴最合適的水土比為2∶1，碳源為葡萄糖，濃度TOC葡萄糖：TOCPAHs為2∶1。該研究結果可為泥漿體系中混合微生物菌群強化修復多環芳烴污染土壤的技術研發提供理論基礎和技術支撐。

多環芳烴；泥漿體系；混合微生物；水土比；葡萄糖

多環芳烴（polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）是分子中具有兩個或兩個以上苯環結構的一類有機污染物，具有疏水性，容易被固體顆粒和腐殖質所吸附［1］。PAHs在環境中廣泛存在，并且在土壤環境中會長期殘留，并不斷積累［3］，屬于難降解的有毒有機污染物，具有很強的“三致性”［4］。

修復PAHs污染土壤是當下環境治理的熱點，目前所采用的方法包括物理法（如土壤蒸汽浸提、熱脫附）、化學法（如化學氧化、土壤淋洗）、以及生物法（如微生物修復、植物修復）。其中，微生物修復技術以利用微生物來降解污染物為技術核心，被認為是一類費用低、效率較高的修復方法。人們可以通過不同技術途徑來實施微生物修復，如生物泥漿反應技術是將受污染的土壤挖掘出來與水混合攪拌成泥漿，在體系中接種微生物進行處理，再將土壤經脫水后運回原地。生物泥漿反應技術作為微生物修復技術之一，以水相為主要處理介質，污染物、微生物、溶解氧和營養物的傳遞速度快，具有處理周期短、降解條件易于控制和處理效果好的特點［5］。因此在高濃度、難降解有機物污染土壤的快速修復工程中具有良好的開發價值和廣泛的應用前景。在自然界中，一些微生物可以以PAHs作為碳源，快速高效降解土壤中的PAHs。還有一類在絕大多數微生物無法生存的極端環境中仍然能夠正常生長繁殖的微生物，稱為嗜極菌或極端微生物（extremophiles），其中嗜熱菌（thermophiles）是指在高溫環境中生長的微生物，具有高效降解環境有機污染物的潛力。嗜熱菌在高溫條件下降解有機污染物，代謝速度快，嗜溫雜菌的競爭減少，同時高溫環境下一些難降解有機物的溶解度和生物可利用性大大提高，有機污染物可得到快速、徹底降解［6］。

生物泥漿反應技術作為一種重要的環境處理技術，在歐、美等發達國家受到廣泛重視，國內外利用該技術進行有機污染物的生物修復已有文獻報道［7-10］，而利用嗜熱菌與PAHs特異性降解菌的混合微生物菌群降解泥漿體系中PAHs的研究還相對較少。因而，本研究采用模擬泥漿體系，利用嗜熱菌群和PAHs特異性降解菌的混合微生物進行PAHs的去除效果研究，探討工藝參數和優化條件，為混合微生物菌群泥漿修復技術的應用提供理論基礎和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試土壤為黃棕壤，采自南京市下馬坊公園林下表層（0 ～ 20 cm）。土樣自然風干后粉碎過2 mm篩，一部分經高溫高壓（121.0℃，30 min）滅菌處理，作為供試滅菌土樣備用；另一部分作為供試自然土樣裝瓶備用。土壤的基本性質見表1。

表1 供試土壤基本理化性質Table1 Physical and chemical properties of the experimental soil

供試微生物為嗜熱菌和降解菌。嗜熱菌由江蘇宜興國豪生物環保有限公司提供，為該公司餐廚垃圾高溫快速堆肥化反應器所用菌劑，分離菌種并鑒定其主要微生物為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）、巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）和嗜熱脂肪芽孢桿菌（Bacillus stearothermophilus）。降解菌由中國科學院南京土壤研究所土壤環境化學與環境保護研究室提供，為鞘氨醇單胞菌［11］（Sphingobium sp.）No. CCTCC AB 2010361。

化學試劑：菲、芘購自上海Aladdin公司，純度為97%；二氯甲烷、正己烷、丙酮、無水硫酸鈉和層析用硅膠（100目）均為分析純；甲醇為色譜純。

1.2 試驗儀器

立式壓力蒸汽滅菌器（LDZX-30KBS），恒溫培養振蕩器（ZWY-240），高速冷凍離心機（CT14RD），超凈工作臺（SW-CJ-ID），冷凍干燥器（SIGMA），旋轉蒸發儀（RE2000B），超聲波清洗器（KQ5200B）和高效液相色譜儀（Agilent 1200）。

1.3 試驗方法

污染土壤的制備：配制菲、芘的丙酮溶液，均勻加入到供試自然土壤和滅菌土壤中，待丙酮揮發完全后混勻，用未污染土樣調節，使土壤中菲、芘含量均為5 mg/kg，制得的菲、芘污染土壤避光儲存備用。

菌株的活化與菌懸液的制備：取出冰箱中保存的嗜熱菌和PAHs特異性降解菌，在無菌條件下，接入到牛肉膏蛋白胨液體培養基中，40℃ 150 r/min恒溫振蕩培養24 h后，8 000 r/min離心5 min，用經過高溫高壓滅菌的無機鹽培養基沖洗菌體3次，收集菌體，用無機鹽培養基稀釋，使菌懸液在600 nm處OD值約為1.0。

泥漿體系中混合微生物菌群去除PAHs試驗：本研究對泥漿體系的強化調控因子有 3個，分別是微生物，水土比（2∶1、2.5∶1和3∶1）以及不同濃度的碳源（葡萄糖、淀粉和水楊酸）。取20.0 g人工制備的污染土壤于150 ml三角瓶中，依據不同的實驗目的設置滅菌不添加混合微生物菌群的污染土壤和不滅菌添加混合微生物菌群的污染土壤，研究混合微生物菌群對PAHs的降解效果，并確定合適的修復時間；設置不同水土比的泥漿體系，選擇最合適的水土比；在體系中添加不同種類的碳源標準備用液，使體系中TOC外加碳源∶TOCPAHs為1∶1、2∶1、5∶1和10∶1?；旌衔⑸锇?%（v/v）的接種量接種，選擇嗜熱菌和常溫降解菌都能夠較快速生長繁殖的溫度40℃［6］，于150 r/min避光條件下模擬生物泥漿反應器恒溫振蕩，定時取樣。試驗所用的所有容器及培養液都經過高溫高壓滅菌處理。

泥漿體系中PAHs的測定［13］：將樣品轉移至50 ml玻璃離心管中，3 000 r/min離心30 min，上清液和等體積甲醇混合，過0.22 μm孔徑濾膜，4℃ 保存供PAHs含量測定（經過測定，上清液中PAHs的含量很少，無法測出）。土壤樣品經冷凍干燥后過60目篩，取2.0 g上述制備的土壤樣品于50 ml玻璃離心管中，加入2.0 g無水硫酸鈉，充分混勻。然后加入10.0 ml二氯甲烷，蓋緊后超聲萃取l h，4 000 r/min離心5 min；取3.0 ml上清液過硅膠柱凈化，并用體積比為1∶l 的二氯甲烷和正己烷溶液洗脫；洗脫液收集至旋轉蒸發瓶后，40℃下濃縮至干，用甲醇定容到2.0 ml，過0.22 μm孔徑濾膜后，-20℃ 保存供PAHs含量測定。經檢測，該提取方法菲的回收率達到93.2%，芘的回收率達到90.7%。

HPLC分析條件：色譜柱為4.6 mm × 150 mm烷基C18反相柱；流動相為甲醇∶水= 90∶10，流速1 ml/min；柱溫為30℃；進樣量20 μl；檢測波長菲為254 nm，芘為240 nm。

2 結果與分析

2.1 混合微生物菌群對泥漿體系中菲和芘的去除效果

圖1是滅菌不添加混合微生物菌群和不滅菌添加混合微生物菌群的兩種泥漿體系中菲和芘的去除率曲線，可見，經過滅菌處理的泥漿體系經過30 天恒溫振蕩培養，菲的去除率不足50.0%，芘的去除率也僅為31.7%，體系中菲和芘去除作用的原因是可能是土著微生物得到了一定程度的恢復促進了菲、芘的降解，或是由于泥漿體系的升溫過程使得部分PAHs揮發所致；而未滅菌添加混合微生物菌群的泥漿體系經過18天恒溫振蕩培養，菲的去除率達87.6%，芘的去除率為92.5%。結果表明，在未滅菌泥漿體系中混合微生物菌群處理對PAHs的去除效果顯著（P＜0.01）。根據單因素方差分析，培養12天和18天，菲的去除率已經沒有顯著性差異（P＞0.05）；培養18天和24天，芘的去除率也沒有顯著性差異（P＞0.05）。因此在后續試驗中，將體系運行時間確定為18 天，既可以較為深度地修復菲和芘污染土壤，又可以有效節約處理成本。

菲和芘的降解動力學方程采用一級動力學模型進行擬合：C = C0e-λt，式中：C為t時間土壤中菲或芘的濃度；C0為土壤中菲或芘的初始濃度；λ為反應速率常數。采用最小二乘法和擬牛頓法，對土壤中菲或芘降解的動力學方程進行擬合，可以得到降解動力學模型中的各個參數值，結果見表2。

圖1 滅菌體系與不滅菌添加混合微生物菌群體系中菲（A）和芘（B）的去除曲線Fig. 1 Removal curves of phenanthrene （A） and pyrene （B） in soil slurry with time in sterilization system and mixed microbes system

表2 滅菌體系與不滅菌添加混合微生物菌群體系中菲和芘的降解動力學方程和模型參數Table2 Degradation kinetic equations and parameters for phenanthrene and pyrene in sterilization system and mixed microbes system

在本實驗條件下，滅菌的泥漿體系中菲和芘的半衰期分別為29.8天和55.6 天，而不滅菌添加混合微生物菌群的泥漿體系中菲和芘的半衰期分別為1.8天和4.9 天。這說明混合微生物菌群的存在大大加速了泥漿體系中菲和芘的去除速率，縮短了菲和芘的半衰期，證明了泥漿體系中利用混合微生物菌群降解PAHs的可行性。從表2中還可以看出菲的擬合相關性相對較弱（擬合R2＝0.72），這可能是由于土壤中的菲在6天之內基本就被微生物降解，之后土壤中殘余的少量菲去除速率很小的緣故。

2.2 水土比對泥漿體系中菲和芘去除效果的影響

將污染土壤和水均勻地攪拌成泥漿便于泥漿體系中PAHs與微生物、營養物質、氧氣等充分接觸，使生物降解更徹底。其中適宜的水土比是生物反應器中的重要參數之一。本實驗中設計了不同水土比研究其對泥漿體系中菲和芘去除效果的影響，見圖2。由圖2可見，相同時間不同的水土比，分析其對泥漿體系中菲和芘的去除效果略有不同，經過2天培養，水土比為2∶1的泥漿體系菲的去除率明顯高于2.5∶1和3∶1的泥漿體系；經過4天和6 天培養，水土比為2∶1的泥漿體系芘的去除率明顯高于2.5∶1和3∶1，造成這種現象的原因可能是由于水土比低的泥漿體系中微生物、營養物質的濃度高而有利于微生物的快速生長繁殖，進而加速了體系中菲和芘的去除。而在體系運行至12天時，不同水土比的泥漿體系中菲和芘的去除率差別不大，這可能是由于試驗進行到后期，不同水土比的泥漿體系中菲和芘已經得到較充分的去除。

利用18天內土壤中菲和芘的含量數據對菲和芘的降解動力學方程采用上述一級動力學模型進行擬合，可以得到降解動力學模型中的各個參數值，結果見表3。

由表3可知，菲在2∶1水土比條件下的半衰期最短為3.1天，2.5∶1和3∶1水土比條件下的菲的半衰期分別為3.6天和3.9天，隨著水土比的增大，菲的半衰期稍有增長；芘在2∶1水土比條件下的半衰期最短為5.0 天，2.5∶1和3∶1水土比條件下的芘的半衰期分別為5.8 天和5.9天，隨著水土比的增大，芘的半衰期也稍有延長。

圖2 不同水土比對泥漿體系中菲（A）和芘（B）去除效果的影響Fig. 2 Influence of water/soil ratio on the degradation of phenanthrene （A） and pyrene （B）

表3 不同水土比體系中菲和芘的降解動力學方程和模型參數Table3 Degradation kinetic equations and parameters for phenanthrene and pyrene in different water/soil ratios

根據上述結果分析，水土比對泥漿體系中菲和芘的去除效果有一定的影響，但是反應后期，不同水土比條件下菲和芘的去除效果差異不顯著（P＞0.05），在有利于攪拌通氣的情況下，盡量采用最小的水土比，可以有效利用反應器的容積，增加單位體積處理污染土壤的數量，因此本實驗選擇最適宜的水土比是2∶1。

表4 添加不同碳源的泥漿體系中菲的去除率（%）Table4 Removal rate of phenanthrene from soil sully with different carbon sources

表5 添加不同碳源的泥漿體系中芘的去除率（%）Table5 Removal rate of pyrene from soil sully with different carbon sources

2.3 碳源對泥漿體系中菲和芘去除效果的影響

選擇3種常見易獲取的葡萄糖、淀粉和水楊酸作為碳源，對泥漿體系進行強化，其添加量為TOC外加碳源∶TOCPAHs為1∶1、2∶1、5∶1和10∶1，即為5、10、25和50 mg/L。為了比較不同碳源對修復過程中菲和芘去除效果的影響，選擇對12天各體系中菲和芘的去除率進行比較。根據表4和表5顯示結果，在體系中添加一定濃度的不同碳源，對菲的去除率均有不同程度的提高，其中向體系中添加10 mg/L的葡萄糖對菲的去除率的提高最有效；向體系中添加淀粉和低濃度的水楊酸（5 mg/L）作為碳源，對芘的去除率沒有顯著影響（P＞0.05），而向體系中添加高濃度的水楊酸，會對芘的去除產生抑制作用，且水楊酸的濃度越高，對芘去除的抑制作用越大，低濃度的葡萄糖（5、10 mg/L）對芘去除有促進作用，而高濃度的葡萄糖對芘去除有抑制作用，這可能是由于PAHs降解菌較容易利用速效碳源物質葡萄糖，抑制了微生物對芘的利用，從而造成了降解率的下降。考慮到碳源種類和濃度對PAHs去除效果的影響，在實際應用中應該選擇向泥漿體系中添加適量的葡萄糖，使TOC葡萄糖∶TOCPAHs為2∶1。

3 討論

微生物降解是PAHs污染土壤最有效的修復技術之一。降解PAHs的微生物主要為細菌和真菌［14］。本研究中，未滅菌添加混合微生物體系與滅菌體系相比，PAHs的去除率顯著提高，這說明微生物降解是泥漿體系中PAHs去除的主要途徑。這與張巧巧［16］等和劉巍巍等［17］的研究結論一致。這表明，在有機污染土壤中人為投加適合降解該污染物的、與土著微生物有很好相容性的高效菌株，可以明顯促進土壤中有機污染物的降解。

從圖1可以看出，隨著時間的延長，菲和芘的去除率逐漸提高，而去除速率則逐漸減小。在試驗前期，混合微生物菌群對泥漿體系中PAHs的生物降解能力較強，隨著時間的延長去除率逐漸升高，但試驗進行到后期，去除速率逐漸降低，最終混合微生物菌群的去除率基本保持穩定，說明降解過程基本停止。這一現象與陳海英等［18］以及李培軍等［5］的研究結果相似。產生這種現象的原因是PAHs的生物有效性降低［19］以及養分含量減少［20］。泥漿體系中剩余較低濃度的菲和芘很難為微生物所利用，要去除這部分菲和芘，必須提供其他的降解條件。

菲和芘分別代表典型的3環和4環的PAHs類有機污染物，其分子結構和物理化學性質都有明顯不同，被微生物分解的難易程度也不同。從表2和表3可看出，菲的半衰期比芘短，這說明菲的去除較芘更快。有研究［21］表明，隨著分子量的增加，PAHs的生物降解率大體呈現出減小的趨勢。這主要是由于隨著分子量的增大，PAHs的憎水性增強，揮發性減小，PAHs的沉積物-水分配系數增大，容易被固體顆粒和腐殖質表面吸附，PAHs從土壤中釋放的速度也越慢，且PAHs環狀結構越復雜，越不易被微生物分解。但這種規律并非絕對，付登強等［23］人研究表明，酸性土壤中PAHs的去除率大小順序為六環＞五環＞三環＞四環；而中性和堿性土壤中PAHs的去除率大小順序為六環＞三環＞五環＞四環。

將污染土壤和水均勻地攪拌成泥漿有利于微生物的深度降解過程，其中水土比是生物反應器中的重要參數之一，可以顯著影響PAHs的生物有效性。土壤中PAHs的吸附-解吸過程是控制其生物有效性及其降解的主要過程之一［24］。在本研究中，試驗初期2∶1的水土比對土壤中菲和芘的去除率較高，而在試驗進行至12 天，不同水土比的泥漿體系中混合微生物菌群對菲和芘的去除率差別不大。Doick和Semple［26］研究了泥漿反應器的水土比對菲礦化的影響，發現在一定范圍內增加水土比，菲礦化率增加，水土比在2∶1到5∶1之間菲的礦化率最高。鞏宗強等［27］、許華夏等［28］以菲和芘為供試污染物，以水土比為調控因子，進行生物泥漿反應器對PAHs微生物降解研究，發現不同水土比（2∶1、3∶1、4∶1和5∶1）對微生物數量及PAHs的降解率均影響不大。

特定土壤微生物能夠利用PAHs作為唯一碳源和能源或利用其他物質作為共代謝底物對PAHs進行深度降解，這是微生物強化降解去除土壤中PAHs的重要途徑之一。目前已有利用有機廢棄物、葡萄糖和淀粉等碳源物質來提高PAHs降解效率的相關研究［29］。在本研究中，在泥漿體系中添加一定量的不同碳源，對菲的去除率均有不同程度的提高，而對芘的去除率既有促進也有抑制。對菲和芘的去除率提高最有效的碳源是葡萄糖，濃度為TOC葡萄糖∶TOCPAHs＝2∶1。Zhang等［29］研究了有機廢棄物污泥和牛糞對紫花苜蓿-微生物去除土壤中PAHs的影響，發現加入污泥和牛糞可有效增加紫花苜蓿-微生物對土壤中PAHs的去除。鄒德勛等［30］以急性毒性較強的菲和遺傳毒性較強的苯并［a］芘為代表性PAHs污染物研究了PAHs長期污染土壤的微生物強化修復，結果表明，添加碳源（淀粉和葡萄糖）提高了土壤PAHs的降解率。王蕾等［31］研究也表明外源添加碳源——鄰苯二甲酸和葡萄糖對芘的降解效率有不同程度的提高。添加的碳源一方面改善了土壤微生物的營養條件，另一方面可以作為PAHs共代謝底物，因此對微生物降解PAHs有促進作用。碳源與目標污染物之間需要保持適當的濃度比例，否則高濃度的碳源會存在競爭而對PAHs的降解產生抑制。

4 結論

1） 40℃的泥漿體系中，利用兩種優勢微生物的混合接菌方式可有效改善PAHs的去除效果，顯著縮短菲和芘的半衰期。隨著反應進程進行，菲和芘的去除率逐漸提高，而去除速率逐步降低，其中菲的去除較芘相對更快。確定該體系運行時間為18 天，既可以充分修復菲和芘污染土壤，又可以節約處理成本。

2） 水土比對泥漿體系中PAHs的去除效果有影響，反應初期2∶1的水土比對體系中菲和芘的去除率均較高，而在試驗進行至12天，不同水土比的泥漿體系中混合微生物菌群對菲和芘的去除效果差異不顯著，因此，確定該反應體系最適宜的水土比為2∶1。

3） 在泥漿體系中添加一定量的不同碳源，對菲的去除率均有不同程度的提高，而對芘的去除率既有促進也有抑制，其中對菲和芘的去除率提高最有效的碳源是葡萄糖，濃度為TOC葡萄糖∶TOCPAHs＝2∶1。

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Removal of Phenanthrene and Pyrene from Soil Slurry by Mixed Microbes and Its Influencing Factors

LIU Yifan， ZONG Lianggang*， SHI Yanfu， SUN Mingming， DU Xiafei
（College of Resources and Environmental Sciences， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095， China）

Phenanthrene and pyrene were used as representative polycyclic aromatic hydrocarbons （PAHs） to investigate their removal efficiencies from soil slurry by mixed microbes of thermophilic bacteria and PAHs degrading bacteria and their influencing factors of soil/water ratio， and the concentrations of glucose， starch and salicylic acid with indoor simulated experiments. The experiments were conducted at 40℃. At this temperature， the two kinds of microbes grow and reproduce quickly. The results showed that the removal rates of the two PAHs from soil slurry by the mixed microbes were significantly greater than those in control （P＜0.01）. The maximum removal rates of phenanthrene in a single day was 20%， and that of pyrene was 15.3%. With the progress of the reaction， the removal rates of phenanthrene and pyrener increased significantly， but the removal reaction rate gradually decreased. The half-life of phenanthrene was 1.8 d， and less than 4.9 d of pyrene. Therefore， the removal of phenanthrene was faster than that of pyrene. The most appropriate water/soil ratio for the removal of the PAHs by the mixed microbes in soil slurry was 2∶1， and the carbon source was glucose with TOCglucose/TOCPAHsratio of 2∶1. The results presented in this study can provide theoretical basis and technical support for remediation of PAHs contaminated soil by mixed microbes.

PAHs； Soil slurry； Mixed microbes； Soil water ratio； Glucose

X53

10.13758/j.cnki.tr.2016.05.018

國家自然科學基金項目（41401345）資助。

*通訊作者（zonglg@njau.edu.cn）

劉一凡（1991—），女，河北衡水人，碩士研究生，主要研究方向為污染土壤生物修復。E-mail： 2013103043@njau.edu.cn