基于VEGF調控SDF-1/CXCR4信號探討可樂定促進滋養細胞的增殖和遷移

張 瑾 趙欣媛 張建華

西安醫學院第二附屬醫院產二科，陜西西安710024

基于VEGF調控SDF-1/CXCR4信號探討可樂定促進滋養細胞的增殖和遷移

張 瑾 趙欣媛 張建華

西安醫學院第二附屬醫院產二科，陜西西安710024

目的探討可樂定（CLO）對滋養細胞增殖、遷移的促進作用及分子機制探討。方法不同濃度的CLO與HTR8-SVneo滋養細胞共培養，MTT和Transwell方法檢測HTR8-SVneo細胞的增殖和遷移，RT-PCR和Western blot技術檢測血管內皮生長因子（VEGF）、基質細胞衍生因子（SDF-1）及其趨化因子受體（CXCR4）的表達水平；將CLO分別與VEGF受體抑制劑（DC101）、CXCR4抑制劑（AMD3100）共同作用于HTR8-SVneo細胞，檢測細胞的增殖、遷移能力和CXCR4的表達水平。結果CLO顯著促進HTR8-SVneo細胞的增殖和遷移（P＜0.05），并上調VEGF、CXCR4的表達水平（P＜0.05）；抑制劑DC101和AMD3100均可抑制可樂定對滋養細胞增殖和遷移的促進作用，且VEGF可調控SDF-1、CXCR4的表達（P＜0.05）。結論CLO可通過VEGF激活SDF-1/CXCR4信號，促進HTR8-SVneo滋養細胞的增殖和遷移。

可樂定；HTR 8-SVneo細胞；增殖遷移；血管內皮生長因子；基質細胞衍生因子/基質細胞衍生因子趨化因子受體

妊娠高血壓疾病是妊娠期特有的并發癥，嚴重危害母嬰健康，是孕產婦和胎兒發病和死亡的主要原因之一［1］。近年的研究表明，滋養層細胞通過遷移、入侵子宮內壁，促進胚胎著床穩定，完善胎盤的生長發育［2-3］。胚胎的穩定著床、生長發育和胎盤的形成都與絨毛外滋養層細胞增殖遷移和浸潤等過程密切相關［4］。可樂定（clonidine，CLO）是咪唑類衍生物，化學名為N-（2，6-二氯苯基）-4，5-二氫-1H-咪唑-2-胺，是一種α2-腎上腺素受體激動劑，臨床上用于治療高血壓的一種中樞性降壓藥［5-6］，主要用于治療中、高度高血壓，與其他類降壓藥合用時具有協同作用［7］。有研究表明［8］，CLO可以促進血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的生成，調節胎盤血管內皮細胞與滋養層細胞之間的交聯。VEGF可以上調基質細胞衍生因子（stromal cell-derived factor-1，SDF-1）及其趨化因子受體（chemokine receptor-4，CXCR4）的表達［9-11］，SDF-1/CXCR4信號具有抗凋亡作用［12］，而CXCR4拮抗劑可以抑制SDF-1/CXCR4信號，抑制人胰腺癌細胞的遷移和入侵［13］。本研究在已有工作的基礎上，以經典的HTR8-SVneo滋養細胞為研究對象，探討CLO對滋養層細胞增殖和遷移的影響及可能的分子機制。

1 料與方法

1.1 實驗材料與試劑

1.1.1 實驗材料HTR8-SVneo細胞，購于中科；上海生命科學研究；細胞中心。

1.1.2 實驗試劑CLO粉劑、AMD3100（CXCR4抑制劑，Sigma公司；DC101（VEGF受體抑制劑，英國Imclone公司）；胎牛血清（FBS，美國Gibco公司）；RPMI-1640培養基（杭州四季青）；RT-PCR試劑盒、RTPCR引物（大連寶生物公司）；抗體（美國BIO SYSTEM公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養與分組HTR8-SVneo細胞用RPMI-1640培養基（10%FBS）置于培養箱（37℃、5%CO2）中孵育，選用處于生長期的細胞進行實驗。分組如下：①control組（Con），②CLO組（CLO作用濃度分別為0.1、1、10μmol/L），③CLO+DC101組（10μmol/LCLO，40μg/mLDC101），④CLO+AMD3100組（10μmol/LCLO，1μmol/L AMD3100），⑤CLO+DC101+AMD3100組（10μmol/LCLO，40μg/mLDC101，1μmol/LAMD3100）。1.2.2 MTT檢測細胞增殖細胞接種于培養板（0.2×104個/孔），按照以上分組分別加入不同濃度的CLO和抑制劑DC101、AMD3100，培養48 h后加入MTT，再培養4 h后加入DMSO，震蕩10min，酶標儀測定570 nm處的OD值。

1.2.3 Transwe l l檢測細胞遷移Transwell板上室加入HTR8-SVneo單細胞懸液（1×105個/孔），再按照以上分組加入不同濃度的CLO和抑制劑DC101、AMD3100，下室加入RPMI-1640培養液（10%FBS），培養48 h后甲醇固定濾膜下表面的細胞，蘇木精染色，高倍顯微鏡（200×）下計數。

1.2.4 RT-PCR檢測VEGF、CXCR4 mRNA表達細胞接種于培養板（1×105個/孔），按照分組加入不同濃度的CLO和抑制劑DC101、AMD3100，培養48 h后收集細胞，Trizol提取細胞總RNA，加入引物逆轉錄合成cDNA，RNA反轉錄的反應條件：25℃5 min，42℃60 min，70℃5 min；SYBR-Premix Ex-TaqⅡ試劑盒及ABI7500 RT-PCR儀進行DNA擴增；產物進行瓊脂糖凝膠電泳，凝膠掃描成像。RT-PCR引物具體見表1。

1.2.5 Wes tern b l ot檢測VEGF、CXCR4蛋白表達細胞提取總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，總蛋白經SDS-PAGE電泳分離，轉膜，封閉1 h，再分別加入相應的一抗稀釋液（1：1000），4℃封閉過夜，洗膜后加入二抗（1：500）孵育1 h，顯影成像。

表1 RT-PCR引物

1.3 統計學方法

采用SPSS 11.5進行實驗數據分析，電泳圖像用Quanity One軟件進行灰度分析，正態分布計量資料以均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用One-way ANOVA。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 果

2.1 CLO促進HTR 8-SVneo細胞增殖和遷移

不同濃度CLO（0.1～10μmol/L）作用于HTR8-SVneo細胞發現，和Con組比較，CLO顯著促進細胞的增殖和遷移（P＜0.05），且呈劑量依賴關系。見圖1。

圖1 可樂定促進HTR8-SVneo細胞增殖和遷移

2.2 可樂定上調VEGF、SDF-1、CXCR 4的表達水平

與Con組比較，CLO促進滋養細胞VEGF、SDF-1和CXCR4mRNA和蛋白的表達，且隨著濃度的增加而上調（P＜0.05）。見圖2。由此可以推測，CLO對滋養細胞增殖、遷移的促進作用可能與上調VEGF、SDF-1、CXCR4的表達水平有關。

圖2 可樂定促進HTR8-SVneo細胞VEGF、CXCR4表達水平

2.3 DC101/AMD3100抑制HTR 8-SVneo細胞增殖和遷移

CLO（10μmol/L）分別與抑制劑DC101或AMD3100作用于滋養細胞，與CLO組比較，抑制VEGF、CXCR4的表達，滋養細胞的增殖和遷移指數明顯下降（P＜0.05）。見圖3。由此可知，VEGF和CXCR4可以促進滋養細胞的增殖和遷移。

圖3 DC101和AMD3100抑制HTR8-SVneo細胞的增殖和遷移

2.4 VEGF可調控SDF-1/CXCR 4信號

已知CXCR4是SDF-1特異受體，兩者交聯后可以產生信號通路，加入VEGF的抑制劑DC101后，SDF-1和CXCR4的表達水平顯著下降（P＜0.05）（圖4）。說明VEGF可以調節SDF-1/CXCR4信號的激活，進而發揮作用。

3 論

CLO可用于治療妊娠高血壓［5］，尤其與其它類降壓藥合用時具有協同作用，療效更加顯著［14］，但其作用機制還不十分清楚。我們前期的實驗結果表明，CLO在0.1～10μmol/L濃度范圍可顯著促進HTR8-SVneo滋養細胞的增殖和遷移。VEGF是血管內皮生長因子，在妊娠過程中，VEGF及其受體主要在胎盤組織的滋養層細胞、血管內皮細胞中表達，可以促進滋養層細胞增殖、侵襲等［15-16］。趨化因子SDF-1在胚胎發育、血管生成等生理過程中發揮重要作用［17］，文獻報道，CXCR4是目前已知的SDF-1特異受體［18］，兩者交聯后可以產生信號通路，參與人體很多生理活動，例如促進血管的生成［19-20］，作為淋巴細胞的共刺激分子參與免疫調節作用，參與妊娠期胚胎的著床過程［21］等。為了進一步探究可樂定的促滋養細胞增殖遷移的作用是否與VEGF和CXCR4有關，通過實驗發現可樂定可以上調滋養細胞VEGF和SDF-1/CXCR4的表達，且具有劑量依賴性，進一步探究可知，分別抑制VEGF、CXCR4的表達，可樂定對滋養細胞增殖、遷移的促進作用被減弱，說明CLO促進滋養細胞增殖和遷移的作用機制與VEGF、SDF-1/CXCR4的表達有關，且VEGF可以正向調控SDF-1/CXCR4的激活，從而得出結論，CLO通過VEGF激活SDF-1/CXCR4信號，從而發揮促進滋養細胞增殖和遷移的作用。絨毛外滋養層細胞在妊娠期發揮著十分重要的作用［22］，滋養層細胞的正常增殖、遷移、浸潤等，可以確保胎盤著床穩定，胎兒健康發育［23］，還可分泌各種分子，促進子宮內血管生成［24］。研究表明，娠高征患者胎盤著床淺，子宮螺旋小動脈障礙［25］，絨毛血管發生異常，這些病癥與滋養層細胞的增殖、遷移、浸潤至子宮肌壁間等密切相關［26-28］。本實驗結果表明CLO可以促進滋養細胞的增殖和遷移，且通過VEGF激活SDF-1/CXCR4信號發揮作用，說明VEGF和SDF-1/CXCR4信號可以作為CLO治療妊娠高血壓的新靶咖，為臨床研究提供依據。然而體內是一個極其復雜的環境，各種分子和信號通路相互交聯相互作用，故具體的作用機制還有待進一步的深入研究。

圖4 DC101抑制HTR8-SVneo細胞SDF-1和CXCR4的表達

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Clonidine promotes HTR8-SVneo cells proliferation and m igration ability via activating SDF-1/CXCR4 signal by VEGF

ZHANG Jin ZHAO Xinyuan ZHANG Jianhua
The Second Division of Obstetrics，Second Affiliated Hospital to Medical School of Xi'an Medical College，Shaanxi Province，Xi'an 710024，China

Ob jective To investigate the effects of Clonidine on proliferation and migration of HTR8-Svneo cells and exploremechanism.Methods MTT and Transwellmethodswere used to determine the proliferation andmigration abilities of HTR8-SVneo cells after incubated with Clonidine.Vascular endothelial growth factor（VEGF）and stromal cellderived factor-1（SDF-1），chemokine receptor-4（CXCR4）were evaluated by RT-PCR and Western blot.The proliferation and migration weremeasured after incubated with VEGFR inhibitor（DC101）or CXCR4 antagonist（AMD3100）.And CXCR4 expression level was evaluated after incubated with DC101.Results Clonidine can promote proliferation and migration of HTR8-SVneo cells（P＜0.05）.VEGF and CXCR4 expression level were notably up-regulated（P＜0.05）. DC101 and AMD3100 inhibit HTR8-SVneo cells proliferation，migration and DC101 suppressed CXCR4 expression（P＜0.05）.Conclusion Clonidine promotes proliferation and migration abilities of HTR8-SVneo cells by activating SDF-1/CXCR4 signaling via VEGF.

Clonidine；HTR8-SVneo cells；Proliferation；Migration；Vascular endothelial growth factor；Stromal cellderived factor-1/chemokine receptor-4

R714.25

A

1673-7210（2016）05（c）-0035-05

2016-02-17本文編輯：蘇暢）