單色多重熒光實時定量PCR測定端粒長度

仲韻

南京醫科大學附屬淮安第一醫院老年科，江蘇淮安223300

單色多重熒光實時定量PCR測定端粒長度

仲韻

南京醫科大學附屬淮安第一醫院老年科，江蘇淮安223300

目的在羅氏LightCycler 480上建立單色多重熒光實時定量聚合酶鏈反應（MMQPCR）方法測定端粒長度。方法在羅氏480定量PCR儀上使用MMQPCR方法測定39例人外周血白細胞端粒長度（相對T/S比值），并與DNA印跡法（Southern blot）測得的平均末端限制性片段（TRF）長度作比較。結果MMQPCR方法測定端粒長度相對T/S比值為1.13依0.21，Southern blot方法測量平均TRF長度為（7.46依1.21）kb，兩種方法測定結果的相關性分析R2=0.6706（P<0.001）。結論本研究建立的MMQPCR方法測定端粒長度重復性好、省時、簡便、可靠，可高通量處理大量樣品。

端粒長度；多重定量PCR；T/S比值；末端限制性片段

有研究表明，端粒長度是生物學老化的標志[1]，端粒縮短被認為與多種心腦血管病的發生及進展有關[2-5]。端粒長度的測定方法最早由Harley等[6]在1990年提出，即通過Southern blot測定末端限制性片段（TRF）的長度，該方法雖然過程繁瑣，所需DNA量大，但至今仍是端粒長度測量方法的野金標準冶。隨后人們提出了定量熒光原位雜交（Q-FISH）[7]和建立流式熒光原位雜交（Flow-FISH）[8]（流式熒光原位雜交）。2002年，Cawthon[9]首創了熒光定量PCR測定端粒相對長度的方法，即通過計算端粒拷貝數（T）與單拷貝基因拷貝數（S）的比值T/S來反映平均端粒長度，但該方法中端粒DNA和單拷貝基因的擴增是在不同的反應管中進行，使得模板起始量的不同對結果的變異產生重要影響，為解決這一問題，2009年，Cawthon[9]還提出了單色多重定量PCR方法（MMQPCR）[10]。該方法對熒光定量PCR儀有一定要求，即能夠在一個循環中兩次收集SYBR Green熒光信號，而國內外實驗室使用較多的ABI系列如7900HT、7700等無此功能。因此，目前研究者仍普遍采用Cawthon[11]于2002年提出的定量PCR方法測定端粒長度。羅氏480（LightCycler480）熒光實時定量PCR儀被廣泛應用于診斷和研究，但文獻中較少見到其被用于測定端粒長度[11-13]，本文參照Cawthon[9]2009提出的MMQPCR，優化實驗中的參數，闡述在羅氏480實時定量PCR儀上建立MMQPCR的過程，并與傳統的Southern b lot方法測量平均TRF長度作相關性分析。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗標本選自2013年11月1~30日南京醫科大學附屬淮安第一醫院（以下簡稱野我院冶）檢驗科體檢者的肘靜脈新鮮EDTA抗凝血2 mL，共40例，其中男19例，女21例，年齡38~79歲，平均（61.46依11.58）歲。本研究獲得我院醫學倫理委員會審查通過，所有入選者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 單色多重熒光實時定量PCR測定端粒長度使用富士核酸提取系統提取基因組DNA，操作嚴格按照說明書進行。微量紫外分光光度計測DNA的濃度與純度，OD260/280為1.7~1.9為合格，記錄DNA的濃度。使用TB緩沖液將待測樣本DNA濃度稀釋至7 ng/滋L，任意選取一樣本作為標準品，使用Milli-Q超純水按1︰2.5的比例將標準品DNA濃度依次等比稀釋為45、18、7.2、2.88、1.152 ng/滋L，并放于-20益冰箱保存備用。端粒長度的測定參照Cawthon2009年提出的MMQPCR[7]。反應使用的引物由英濰捷基（上海）貿易有限公司合成，序列如下院telg 5憶-ACAC-TAAGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTAGTGT-3憶；telc 5憶-TGTTAGGTATCCCTATCCCTATCCCTATC-CCTATCCCTAACA-3憶；hbgu 5憶-CGGCGGCGGGCG-GCGCGGGCTGGGCGGCTTCATCCACGTTCACCTTG-3憶；hbgd 5憶-GCCCGGCCCGCCGCGCCCGTCCCGCCG-GAGGAGAAGTCTGCCGTT-3憶。反應體系院SYBR Green玉Master（羅氏公司）7.5滋L，樣本DNA 5滋L（待測樣本DNA含量為35 ng，標準品含量依次為225、90、36、14.4、5.76 ng），端粒引物telg、telc終濃度均為500 nmol/L；單拷貝基因引物HBGU、HBGD終濃度均為200 nmol/L。反應在同一塊384孔板上進行，標準品和待測樣本均設置3復孔，另外設置以相同體積的超純水作為DNA的陰性對照，亦為3個復孔。使用儀器為LightCycler 480實時熒光定量PCR儀（羅氏公司）。反應條件為玉院95益15 min；域院94益15 s，49益15 s，2個循環；芋院94益15 s，62益10 s，74益15 s，84益10 s，85益15 s，38個循環。反應結束后建立熔解曲線。從LightCycler480v1.5拷出原始數據，使用軟件野Conversion from LightCycler480 to Lin-RegPCR冶將其轉換并導入LinRegPCR（v12.15）軟件進行分析。

1.2.2 Southe rn b l o t測量平均TRF長度實驗前進行瓊脂糖凝膠電泳檢驗待測DNA的完整性，使用羅氏試劑盒TeloTAGGG Telomere Length Assay（羅氏公司）完成平均TRF的測定，瓊脂糖、尼龍膜亦購于該公司，實驗參照試劑盒提供的步驟進行。具體為院限制性內切酶Hinf I和Rsa I酶切基因組DNA（1.2μg，包括試劑盒提供的對照DNA）2 h，將酶切DNA連同地高辛標記的marker放于0.8%瓊脂糖凝膠中以5V/cm的電壓電泳10 cm，使用毛細管轉移法將DNA轉移至帶正電荷尼龍膜上，120益烘烤30 min，使用試劑盒提供的雜交液42益預雜交1 h后，用地高辛標記的端粒探針42益雜交3 h，洗膜后，加入顯影底液，并將尼龍膜放入LAS-4000數字成像系統中進行連續曝光，曝光時間15~20min，選擇曝光強度最適宜的一張照片進行TRF長度測定。使用圖像處理軟件Image J（v1.44p），根據公式TRF=移（ODi）/移（ODi/Li）計算平均TRF長度。其中，ODi表示位置i的光密度值，Li表示位置i的marker長度，不同批次的結果根據control DNA進行校正。

1.3 觀察指標

淤觀察PCR產物的熔解曲線、端粒與單拷貝基因的標準曲線；于觀察T/S比值的重復性，計算批內變異系數及批間變異系數；盂分析T/S比值與平均TRF長度的相關性。

2 結果

2.1 熔解曲線、標準曲線及相對T/S比值的計算

PCR產物的熔解曲線如圖1所示，熔解曲線為兩個完全分開的雙峰，Tm值分別為78益和91益，分別為端粒擴增產物和單拷貝基因擴增產物。分別計算各個濃度標準品端粒和單拷貝基因的平均Ct值，并以DNA含量的對數值log[DNA]作橫坐標，以Ct值作縱坐標，在Microsoft Excel中繪制端粒和單拷貝基因的標準曲線，得出R2值和公式（圖2）。從圖中可以看出，端粒和單拷貝基因的標準曲線R2均>0.99，且兩條標準曲線幾乎平行，說明端粒和單拷貝基因擴增效率相近，提示在225~5.76 ng范圍內，使用該標準曲線計算待測樣本的端粒長度可靠。將各個待測樣本的原始Ct值代入公式，進行冪轉換，得到每個待測樣本相對于標準品的端粒的納克數（T）和單拷貝基因的納克數（S），最后計算3個復孔T/S比值的平均值，即得到每個待測樣本相對于標準品的T/S比值。

圖1 PCR產物熔解曲線

圖2 端粒和單拷貝基因的標準曲線

2.2 T/S比值的重復性檢驗

計算每個待測樣本3個復孔T/S比值的變異系數，然后計算39個樣本變異系數的幾何均數，得出批內變異系數為2.9%。為了檢驗該MMQPCR方法的批間重復性，同樣的39個樣本于第2天進行重復測量，仍為3個復孔，且保證每個樣本在384孔板上的位置與前一次不同，以減少位置效應。兩次獨立實驗各個樣本T/S均值的相關性見圖3，可以發現線性回歸線的斜率接近于1，且在Y軸上的截距接近于零。計算兩次實驗每對樣本T/S比值的變異系數，最后求得39對樣本變異系數的幾何均數，即批間變異系數為3.4%。

圖3 相同樣本兩次實驗所得T/S均值的相關性

2.3 T/S比值與平均TRF長度的相關性分析

計算39個樣本DNA的平均T/S比值為1.13依0.21，平均TRF長度為（7.46依1.21）kb，從圖4可以看出兩種不同方法測得的結果存在明顯相關性（R2= 0.6706，P<0.001）。

圖4 相對T/S比值與平均TRF長度的相關性

3 討論

MMQPCR將端粒和單拷貝基因置于同一個反應管中擴增，利用端粒和單拷貝基因豐度和產物Tm值的差異，使用SYBR Green染料在一個循環中順序收集端粒熒光信號和單拷貝基因熒光信號。該方法與傳統多重PCR不同的是兩個目標基因的擴增并不是同時進行。端粒首先擴增并在74益收集信號，由于端粒的豐度遠比單拷貝基因高，此時單拷貝基因的Ct值仍在基線水平以下，因此74益的Ct值僅代表端粒。溫度繼續升高到85益，因為此時端粒產物已完全解鏈，釋放DNA聚合酶用于單拷貝基因的擴增，由于單拷貝基因引物5憶端被加了野GC鉗冶，提高了退火溫度，使其在85益仍能擴增，因此此時收集的熒光僅代表單拷貝基因產物。該方法與之前的PCR方法比較，試劑和模板用量以及時間均減少了一半，更為重要的是消除了模板起始量不同對結果產生的影響，減少了批內誤差。

擴增效率是影響定量PCR可靠性的最重要因素[14]，由于實時定量PCR通過Ct值來計算模板的起始量，因此所有樣本的擴增效率一致顯得很重要。端粒的定量PCR利用兩個基因的擴增來計算端粒長度，其中任何一個都有可能存在效率誤差，因而對效率誤差尤為敏感。有文獻報道了端粒定量PCR可接受的效率范圍為95%~103%[16]，但這個范圍只是象征性的，如果所有的樣本的擴增效率一致，具體的數值并不重要，80%和100%一樣可靠，因為導致效率誤差的是樣本之間擴增效率的差別[15]。另一個與擴增效率有關的問題與標準品有關。端粒定量PCR通過外部標準曲線法計算端粒長度，一般來說應使用任一個待測樣本，或多個樣本的混合作為標準品。因為在血樣本的保存及DNA的提取過程中有很多化學物質可抑制PCR反應，如乙醇、酚、EDTA等[17]，而標準品與待測樣本來源相同可以控制抑制因子對PCR的影響，從而減少標準品與待測樣本之間的效率誤差[15]。相反，使用購買的高度純化的標準品[18]和來自細胞系的標準品[19-20]則不能消除抑制因子的影響。

本實驗在羅氏LightCycler480熒光定量PCR儀上進行端粒與單拷貝基因的擴增，利用LinRegPCR軟件進行數據分析，解決了儀器自帶軟件無法分析數據的問題，從而拓寬了MMQPCR方法測定端粒長度的應用范圍。與傳統的Southern blot方法比較，MMQPCR方法具有省時、簡便的特點，可高通量處理大量樣品。

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Telomere length measurem ent by m onochrom e m ultip lex quantitative PCR m ethod

ZHONG Yun
Department of Geriatrics,Huai憶an First People憶s Hospital,Nanjing Medical University,Jiangsu Province,Huai憶an 223300,China

Ob jective To establish amonochromemultiplex real-time quantitative polymerase chain reaction(MMQPCR), for telomere lengthmeasurementon theRoche LightCycler480(LC480)real-time PCR platform.M ethods Telomere lengths (T/S ratio)weremeasured from 39 DNA samples extracted from human white blood cells using the MMQPCR method on the LC480 platform,and were compared with terminal restriction fragment(TRF)lengthsmeasured by Southern blot. Results Relative T/S ratiomeasured by MMQPCR was 1.13依0.21,and mean TRF length was(7.46依1.21)kb.The cor-relation coefficient(R2)for the relationship of the two differentmethodswas 0.6706(P<0.001).Conclusion The MM-PQPCR method is reproducible,rapid,and simple,thus reliable for a high throughput of samples.

Telomere length;Multiplex quantitative PCR;T/S ratio;Terminal restriction fragment

R34

A

1673-7210（2016）07（a）-0014-04

院2016-03-21本文編輯院任念）

仲韻（1988.10-），女，碩士；研究方向院心腦血管病患者生物標志物研究。