纈沙坦通過PI3K/Akt/eNOS通路保護2型糖尿病大鼠主動脈內(nèi)皮細(xì)胞免受氧化損傷的研究

郭敏 李世平 張彤哲 潘劍

蘭州大學(xué)第二醫(yī)院急救中心，甘肅蘭州730030

纈沙坦通過PI3K/Akt/eNOS通路保護2型糖尿病大鼠主動脈內(nèi)皮細(xì)胞免受氧化損傷的研究

郭敏 李世平 張彤哲 潘劍

蘭州大學(xué)第二醫(yī)院急救中心，甘肅蘭州730030

目的觀察纈沙坦對2型糖尿病模型大鼠主動脈內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷的保護作用，并探討其分子機制。方法采用小劑量鏈脲佐菌素（STZ，35 mg/kg）加高脂高糖飲食誘導(dǎo)2型糖尿病動物模型。將30只SD大鼠分為3組院正常對照組、糖尿病模型組和纈沙坦治療組，纈沙坦治療組灌胃給予纈沙坦24 mg/（kg窯d），糖尿病模型組則給予等體積生理鹽水，連續(xù)治療8周。HE染色檢測胸主動脈形態(tài)變化，采用DCFH-DA熒光探針檢測活性氧（ROS）的生成，采用黃嘌呤氧化酶法檢測主動脈組織超氧化物歧化酶（SOD）的活性，Western blot檢測主動脈組織Akt、p-Akt、eNOS和p-eNOS的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果與正常對照組比較，糖尿病模型組ROS含量顯著上升，SOD活性顯著下降（P約0.05）。與糖尿病模型組比較，纈沙坦治療組ROS水平明顯降低，SOD活性明顯升高，p-Akt和p-eNOS的表達(dá)明顯增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P約0.05），而對Akt和eNOS的表達(dá)量無影響（P躍0.05）。結(jié)論纈沙坦能夠保護糖尿病大鼠主動脈內(nèi)皮細(xì)胞免受氧化損傷，其機制可能與激活PI3K/Akt/eNOS通路有關(guān)。

纈沙坦；氧化損傷；PI3K/Akt/eNOS通路

糖尿病是當(dāng)今社會最為常見的慢性疾病[1]。近年來，明顯上升的糖尿病發(fā)病率已經(jīng)對人類健康和壽命構(gòu)成嚴(yán)重威脅[2]。伴隨著高血糖、高血脂等代謝紊亂，糖尿病發(fā)病往往導(dǎo)致體內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）增多，并且激活機體腎素-血管緊張素系統(tǒng)，血管緊張素域（Angiotensin域，Ang域）增加也可刺激ROS的產(chǎn)生；普遍認(rèn)為氧自由基的過量可以導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷，并進一步參與糖尿病血管并發(fā)疾病的發(fā)生發(fā)展過程[3-4]。纈沙坦是AT1受體拮抗劑，是否能夠通過降低ROS產(chǎn)生量從而保護糖尿病內(nèi)皮細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷目前尚不明確。本文旨在觀察糖尿病模型大鼠內(nèi)皮細(xì)胞的氧化損傷以及纈沙坦對其的保護作用，并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

6周齡，體重120耀150 g的健康雄性SD大鼠30只，實驗動物合格證號院SCXK（京）20102008，購自北京維通利華實驗動物有限公司。鏈脲佐菌素（STZ）購自Sigma公司；纈沙坦（Valsartan Capsule）：北京諾華制藥有限公司；超氧化物歧化酶（SOD）測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所。p-AKt、p-eNOS和茁-actin抗體購自美國Santa Cruz公司。

1.2 動物建模及分組

將大鼠按隨機數(shù)字表法分為三組院正常對照組、糖尿病模型組和纈沙坦治療組，每組各10只。采用標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)正常對照組，高糖高脂飼料（其中含蛋黃2.5%、蔗糖20%、豬油10%）喂養(yǎng)其余兩組。4周后，禁食10 h，腹腔注射鏈脲佐菌素（Streptozotocin，STZ）35 mg/kg建立2型糖尿病模型；正常對照組則給予等量生理鹽水。1周后采尾靜脈血并測空腹血糖值（FBG），以FBG值躍16.7 mmol/L且在觀察期間血糖值無明顯下降者即認(rèn)為造模成功。三組大鼠繼續(xù)以原飼料喂養(yǎng)8周，纈沙坦治療組灌胃給予纈沙坦24 mg/（kg窯d），連續(xù)給藥8周。糖尿病模型組則給予等體積生理鹽水替代。

1.3 主動脈血管標(biāo)本制備

以2%巴比妥鈉溶液麻醉大鼠后分離胸主動脈，置于4益預(yù)冷的HEPES液中，并通入95%O2+5%CO2混合氣體。37益恒溫的HEPES浴槽內(nèi)，兩個牽拉鉤垂直懸掛胸主動脈血管環(huán)，并連續(xù)通入95%O2+5%CO2混合氣體。

1.4 HE染色觀察血管形態(tài)學(xué)變化

采用4%多聚甲醛溶液和0.2%的疊氮化鈉制備主動脈血管常規(guī)石蠟切片。脫蠟后，雙蒸水中浸泡10min并進行HE染色。步驟如下院首先進行蘇木精5 min染色；接著采用1%鹽酸乙醇分化1耀3 s；自來水沖洗后置于伊紅2 min；然后進行酒精梯度脫水，二甲苯透明，樹膠封片，最后置于光鏡下觀察病理學(xué)變化。

1.5 主動脈血管中SOD測定

將新鮮血管組織勻漿，制備血管組織上清液后嚴(yán)格按照試劑盒說明測定SOD含量。

1.6 主動脈血管中ROS生成量測定

采用DCFH-DA活性氧檢測試劑盒檢測細(xì)胞內(nèi)的ROS含量。操作步驟嚴(yán)格依照試劑盒的說明。

1.7 W estern blot檢測PI3K/Akt/eNOS通路相關(guān)蛋白水平

從上述各組大鼠主動脈組織分別提取總蛋白，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)移蛋白至NC膜上，進行脫脂奶粉封閉2 h之后用PBS洗膜，分別加入一抗（Akt、p-Akt、eNOS、p-eNOS）（1頤1000稀釋），4毅C孵育過夜。進行常規(guī)洗膜之后，加入域抗即辣根過氧化酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體（1頤2000稀釋）并置于室溫中反應(yīng)1 h。經(jīng)洗膜之后采用IPP6.0軟件分析條帶的灰度值，并以茁-actin作為內(nèi)參確定Akt、p-Akt、eNOS、p-eNOS蛋白的表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 糖尿病大鼠血管損傷情況

與正常對照組比較，糖尿病模型組大鼠血管損傷明顯，而與糖尿病模型組比較，纈沙坦治療組能明顯改善大鼠血管內(nèi)皮損傷（圖1）。

圖1 各組大鼠主動脈組織病理變化（HE染色，200×）

2.2 糖尿病大鼠主動脈細(xì)胞氧化應(yīng)激

糖尿病模型組大鼠主動脈組織熒光強度顯著強于正常對照組，ROS產(chǎn)生量顯著多于正常對照組，SOD生成量[（76.91依15.81）U/mg]顯著低于正常對照組[（173.81依10.85）U/mg]，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P約0.05）；纈沙坦治療組主動脈組織熒光強度明顯弱于糖尿病模型組，ROS產(chǎn)生量明顯少于糖尿病模型組，SOD生成量[（138.83依11.16）U/mg]顯著高于糖尿病模型組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P約0.05）。見圖2。

圖2 各組大鼠主動脈組織熒光強度比較

2.3 PI3K/Akt/eNOS通路蛋白水平

與正常對照組比較，糖尿病模型組p-Akt和peNOS表達(dá)均明顯下降（P約0.05）；與糖尿病模型組比較，纈沙坦治療組p-Akt和p-eNOS表達(dá)均顯著增加（P約0.05），對Akt和eNOS總表達(dá)量無明顯變化（P躍0.05）（圖3）。

圖3 各組大鼠主動脈組織中PI3K/AKt/eNOS通路相關(guān)蛋白水平比較

3 討論

隨著人口老齡化與人們生活水平的提高，糖尿病的患病率逐年攀升，嚴(yán)重威脅著人們的身心健康[5]。血管內(nèi)皮功能障礙的首要誘導(dǎo)因素就是長期經(jīng)受高血糖壓力[6]，并在糖尿病血管病變中起到至關(guān)重要的作用[7]。因此，深入研究糖尿病中血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的改變及其機制，對于防治高糖導(dǎo)致的內(nèi)皮細(xì)胞損傷以及其他心血管并發(fā)疾病具有重要意義[8-9]。

近年來有研究表明，糖尿病患者體內(nèi)血管緊張素水平升高[3,10]。血管緊張素域是腎素-血管緊張素系統(tǒng)主要的效應(yīng)因子，其造成了內(nèi)皮功能障礙及影響著血管的重構(gòu)[11]，很可能參與了糖尿病造成的血管損傷[12]。纈沙坦是血管緊張素域受體AT1拮抗劑[13]，本研究觀察了纈沙坦對高糖誘導(dǎo)的大鼠內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷的作用及并對其機制做了初步探討。結(jié)果顯示，糖尿病模型大鼠血管內(nèi)皮損傷較明顯，ROS生成增加，SOD明顯降低，這表明高糖誘導(dǎo)了血管內(nèi)組織自由基的產(chǎn)生，削弱了內(nèi)源性SOD的保護機制，這可能是內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷的主要原因。而在糖尿病患者中，可能正是由于ROS異常增多，致使脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等發(fā)生氧化損傷，從而導(dǎo)致血管舒張功能障礙，并進一步誘發(fā)動脈粥樣硬化以及高血壓等疾病[14-15]。纈沙坦干預(yù)后，顯著增加主動脈血管組織中SOD，抑制ROS生成，這也提示了糖尿病大鼠內(nèi)皮細(xì)胞的氧化損傷可能部分是由于Ang域增加引起的。纈沙坦能夠?qū)笰ng域的作用，抑制自由基生成和內(nèi)皮細(xì)胞損傷，減少糖尿病血管病變的發(fā)生。

健康患者血管內(nèi)皮細(xì)胞可產(chǎn)生一氧化氮發(fā)揮保護性作用，一氧化氮被認(rèn)為是目前最強的血管舒張因子，在調(diào)節(jié)血管緊張度、抑制血小板聚集、抗平滑肌細(xì)胞增殖、抗炎等方面發(fā)揮重要作用。一氧化氮由一氧化氮合成酶（NOS）催化L-精氨酸合成，NOS主要有三種院神經(jīng)型（nNOS）、內(nèi)皮型（eNOS）和誘導(dǎo)型（iN-OS）[16]。iNOS是炎性條件下生成一氧化氮的關(guān)鍵酶。糖尿病患者一氧化氮的生成量減少，可能與eNOS活性下降有關(guān)[17-18]。研究認(rèn)為PI3K/AKt/eNOS通路可能參與了2型糖尿病內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂[19-25]。本研究顯示，高血糖誘導(dǎo)大鼠內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)p-Akt和p-eNOS表達(dá)明顯下降，與文獻(xiàn)報道一致[16-22]，而纈沙坦治療可促進有活性的Akt和eNOS磷酸化水平升高，這提示纈沙坦對內(nèi)皮細(xì)胞的保護作用可能是通過PI3K/Akt/ eNOS通路介導(dǎo)的，進一步利用p-Akt或p-eNOS抑制劑進行體外實驗可以明確該通路作用。

綜上所述，纈沙坦能夠拮抗高糖誘導(dǎo)氧化應(yīng)激造成的主動脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷，可能通過上調(diào)PI3K/Akt/ eNOS通路發(fā)揮這一保護作用。

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Study on the protective effect of Valsartan against oxidative injury of aortic endothelial cells in rats w ith type 2 diabetes via PI3K/Akt/eNOS pathway

GUOMin LIShiping ZHANG Tongzhe PAN Jian
Emergency Center,Lanzhou University Second Hospital,Gansu Province,Lanzhou 730030,China

Objective To investigate the protective effect of Valsartan on endothelial function of aortas in ratswith type 2 diabetes and its possible molecularmechanisms involved.Methods Type 2 diabetes rats were induced by high fat and high sugar diet and low dose of Streptozotocin(STZ,35 mg/kg).Thirty SD rats were random ly divided into three groups:normal control group,diabetesmodel group and Valsartan treatment group.Valsartan treatment group was given 24 mg/(kg窯d)Valsartan by gavage,diabetes model group was given the same volume of normal saline,treatment for eightweeks continuously.HE staining was used to investigate the histology changes of thoracic aorta.Intracellular re-active oxygen species(ROS)production was detected by the peroxide-sensitive fluorescent probe 2',7'-dichlorofluo-rescin diacetate(DCFH-DA),the activity of superoxide dismutase(SOD)wasmeasured by xanthine oxidasemethod. The protein levels of Akt,p-Akt,p-eNOS and eNOSwere analyzed by Western blot.Resu lts Compared with normal control group,the production of ROS in diabetesmodel group was significantly increased,while the activity of SOD was significantly decreased(P約0.05).Compared with diabetesmodel group,the activity of SOD in the Valsartan treatment group was significantly increased and the production of ROSwas significantly decreased,and the protein levels of p-Akt and p-eNOSwere significantly increased,the differences were all statistically significant(P約0.05),while there were no statistically significant differences in the protein levels of Akt and eNOS(P躍0.05).Conclusion Valsartan can protect aortic endothelial cells in rats with diabetes from oxidative injury,themechanism may be related to the activa-tion of PI3K-Akt-eNOS pathways.

Valsartan;Oxidative injury;PI3K/Akt/eNOS pathway

R587

A

1673-7210（2016）07（a）-0018-04

院2016-03-11本文編輯院張瑜杰）

潘劍，男，醫(yī)學(xué)碩士，主任醫(yī)師；研究方向院急診內(nèi)科。