全氟辛烷磺酸（PFOA）對斜生柵藻的毒性效應研究

蔣美卿　許曉路　張德勇

（1浙江金象科技有限公司浙江東陽3221002浙江樹人大學生物與環境工程學院浙江杭州310015）

全氟辛烷磺酸（PFOA）對斜生柵藻的毒性效應研究

蔣美卿1許曉路2*張德勇2

（1浙江金象科技有限公司浙江東陽3221002浙江樹人大學生物與環境工程學院浙江杭州310015）

為了分析全氟辛烷磺酸（PFOA）對淡水生態系統的危害，選擇斜生柵藻為受試對象。首先設計了急性毒性試驗，計算出PFOA對斜生柵藻的96h-EC50值為139.23 mg/L。然后將斜生柵藻在含有不同濃度PFOA的培養基中連續培養8天，測定葉綠素、抗氧化酶、丙二醛等指標的變化。結果顯示，斜生柵藻的葉綠素含量在PFOA達到50mg/L劑量時開始表現出降低，抗氧化酶類的活性在PFOA達到50mg/L或100mg/L劑量時表現出降低，MDA含量在PFOA達到150mg/L劑量時開始表現為上升。研究結果顯示PFOA在高濃度下會影響藻類的光合作用及多種代謝活動。

PFOA；斜生柵藻；葉綠素；抗氧化酶；丙二醛

全氟辛烷磺酸（PFOA）分子式為C8F17SO3，它由全氟化酸性硫酸基酸中完全氟化的陰離子組成。PFOA是一種持久性有機污染物，具有難以降解、易于經食物鏈在各級生物體內蓄積等特點。PFOA分子中的碳氟鍵高度穩定，水解、光解、生物降解等手段均難以對其發揮降解作用[1]。半個多世紀以來，PFOA作為表面保護劑廣泛應用于毛毯、皮革、紙張、包裝材料、纖維等產品，或作為表面活性劑應用于起泡劑、酸霧抑制劑、堿性清潔劑、地板拋光劑、感光膠片、義齒清潔劑、洗發水等[2]。目前在全球大多數水系中均能檢測到PFOA的污染，其潛在的生態威脅受到高度關注。包括歐盟國家、美國等在內的許多國家已經采取措施限制相關產品的生產和使用。

已有的研究顯示，PFOA對魚類、禽類、大鼠等動物具有多種毒性，涉及生殖毒性、胚胎發育毒性、腎臟毒性等，但在藻類上的研究報道尚且不多見，相關研究尚不夠系統和深入[3]。藻類是水生生態系統中初級生產者，對整個生態系統的生產力和生態平衡至關重要。有些藻類甚至被作為水質評價的指標，因為它們往往在凈化水體富營養化中起到重要作用，對環境變化反應敏感[4]。斜生柵藻（Scenedesmus obliquus）是一種常見的淡水綠藻，易于在營養豐富的水體中繁殖，是一種常用的水質評價指示生物。由于斜生柵藻易于人工培養，也經常用于生態毒理學研究領域。本研究主要擬研究水中的PFOA對斜生柵藻的繁殖及一些關鍵的生化指標有何影響，以初步揭示其對水生生態系統的潛在毒性。

1　材料與方法

1.1材料

斜生柵藻由中科院水生生物研究所提供；PFOA購自百靈威公司；其他常規化學試劑由浙江樹人大學生態與環境保護研究所提供。

1.2藻類培養與染毒方案

斜生柵藻接種于含不同濃度PFOA的HB-4培養基，于250mL的錐形瓶進行培養，起始濃度為7×105個/mL[5]。急性毒性實驗中PFOA濃度為80mg/L～600 mg/L，慢性毒性實驗中為20 to 250 mg/L。藻類培養過程中用4層紗布封口，于24℃、光照黑暗循環(12h/12h)條件培養8天，每天搖動5次。每組設3個重復。每天取樣分析增殖速度，實驗結束（8天）后測定葉綠素含量、抗氧化酶系、MDA等。

1.396h-EC50計算

藻類的生物量用光密度法進行快速測定，基于前期研究中建立的公式“y=0.0134x+0.036”進行藻類細胞密度換算。式中y為A690值，x為細胞數量（*106個/mL）。分別計算出不同濃度PFOA染毒96h后，對藻類生長的抑制率，利用Jiang等報道的方法，計算96h-EC50值[6]。

1.4葉綠素含量分析

取30mL藻液用0.45μm濾膜過濾截留藻細胞，將其帶濾膜剪碎移入研缽，加入少量乙醇研磨，離心后濾液定容到10 mL，于4℃黑暗環境中提取4 h。提取液3000rpm離心20 min，取上清，移入10mL比色管。用90%乙醇定容至10 mL。取上清液于比色皿中，以90%乙醇溶液作參比，于分光光度計上提取液的A665和A649值。葉綠素a濃度（mg/L）=13.95A665-6.88A649；葉綠素b濃度（mg/L）=24.96A649-7.32A665。二者之和為葉綠素濃度。

1.5抗氧化酶系的活力分析

取30mL藻液，4000g離心15 min，沉淀用pH7.8的PBS重懸，進行超聲破碎。10000g離心10 min，上清作為粗酶液，分別測定過氧化氫酶（CAT）、超氧化歧化酶（SOD）和過氧化物酶（POD）的活力。CAT的測定，反應體系中加6 mL0.05 mol/LPBS(pH7.0)、0.4 mL 0.3%H2O2，、0.1 mL粗酶液。每分鐘使A240值升高0.01的酶活力定義為1個CAT酶活單位[7]。SOD活性分析采用Chen等報道的方法，能抑制該反應體系每分鐘ΔA560值達50%抑制率的酶活力定義為1個酶活單位[7]。POD活力的測定參照Bewley等報道的方法，使該反應體系每分鐘A470變化值達0.01的酶活力定義為1個單位[8]。單位質量藻樣中的酶活力=總酶活/樣品總重。

1.6丙二醛（MDA）含量分析

30mL藻液經濾膜濃縮后，加入10%TCA，直接研磨破碎藻細胞，勻漿經10000g離心10min，上清液為丙二醛提取液。吸取2 mL提取液于試管中，加入0.6%硫代巴比妥酸2 mL，于沸水浴上加熱10min，迅速冷卻。于4000 g離心10min，取上清，測A450、A532、A600值。MDA的濃度=6.45（A532-A600）-0.56*A450[9]。

1.7統計分析

利用SPSS軟件(V11.5)，采用One-wayANOVA方法分析不同實驗組結果之間的差異顯著性。

2　結果

2.196h-EC50值

抑制率(P%)和濃度的自然對數(LnC)的線性回歸方程：y=0. 2968x-0.9164，R2=0.9964。經計算，PFOA對斜生柵藻的96h-EC50值為139.23 mg/L。

2.2葉綠素及MDA含量

表1所示，當PFOA劑量大于或等于50 mg/L時，引起斜生柵藻中葉綠素a的含量降低（p＜0.05）；當PFOA劑量大于或等于100 mg/L時，引起斜生柵藻中葉綠素b的含量及總葉綠素含量降低（p＜0.05）；當PFOA劑量大于或等于150 mg/L時，引起斜生柵藻中MDA含量升高（p＜0.05）。這些結果顯示PFOA會影響斜生柵藻中的葉綠素含量與MDA含量。

表1　各處理組的葉綠素含量及MDA含量

2.3抗氧化酶的活性

如表2所示，當PFOA劑量大于或等于50 mg/L時，引起斜生柵藻中SOD活力降低（p＜0.05）；當PFOA劑量大于或等于100 mg/L時，引起斜生柵藻中CAT活力與POD活力降低（p＜0.05）。

表2　各處理組的三種抗氧化酶類的活性

3　討論

在世界各地的水系中普遍檢測到PFOA污染，而關于其對水生生態系統的危害研究報道尚較少。本研究PFOA對斜生柵藻具有毒性效應，能抑制藻類的增殖，并就算出其96h-EC50值139.23 mg/L。八天的染毒實驗進一步證實，這種PFOA暴露會引起斜生柵藻的葉綠素含量下降、MDA含量上升及抗氧化酶類的活性降低。這種效應大多于PFOA劑量達到50mg/L時開始表現出來。當PFOA劑量達到250 mg/L時，葉綠素a含量降低了約77%，葉綠素b含量降低了約45%，MDA濃度升高了約53%，CAT活力降低了約80%，POD活力降低了約74%，SOD活力降低了約77%，反映了高濃度的PFOA對藻類的生理活動影響非常明顯。

本研究主要分析了藻類的葉綠素、抗氧化酶類活性、MDA含量幾個重要的指標。葉綠素是藻類進行光合作用的基本依賴條件，其含量多少直接反映了藻類代謝和增殖活力的強弱。本研究中當PFOA劑量達到100 mg/L時，不管葉綠素a還是葉綠素b均開始表現出含量下降（p＜0.05），反映了PFOA對藻類的光合作用有影響，且與劑量有關。抗氧化酶類通過清除細胞內產生的過多的活性氧可以幫助藻類保持氧代謝平衡，保護細胞膜免受膜脂過氧化損傷，從而維持細胞的完好性。在本研究中，低劑量的PFOA（低于50 mg/L）雖然引起了抗氧化酶類的活性平均水平稍低，但不具有統計學顯著性，這種抑制作用從PFOA劑量達到50 mg/L時開始逐步顯現，并與劑量表現出正相關。MDA含量是細胞膜質過氧化的產物，其含量可反映植物遭受逆境傷害的程度，作為一種抗逆性分子，它在植物處于脅迫環境中時會大量產生，本研究中MDA濃度在PFOA劑量達到150mg/L時開始顯著升高（p＜0. 05），顯示在高濃度PFOA環境中，藻類會發生嚴重的膜脂過氧化，也就意味著細胞的損傷。

4　結語

本研究證實了高濃度的PFOA對水體中的藻類有多方面的毒性作用，會對藻類的光合作用、抗氧化酶類的活力、膜脂完好性等有損害，說明PFOA大量排放會對淡水生態環境造成威脅，應引起重視。

[1]Giesy,J.P.&Kannan,K.2002.Perfluorochemical surfactants in the environment.Environ Sci Technol,Vol.36,p.146A-152A.

[2]Giesy,J.P.&Kannan,K..2001.Global distribution of perfluorooctane sulfonate in wildlife.Environ Sci Technol,Vol.35,p.1339-1342.

[3]Lau,C.,Anitole,K.,Hodes,C.,et al.2007.Perfluoroalkyl acids:a reviewofmonitoring and toxicological findings.Toxicol Sci.,Vol.99-2, p.366-394.

[4]Li,L.J.2007.Studies on Effects of Vanadate and Vanadium Complex on Growth and Physiology of Two Marine Microalgae,publications/Ocean UniversityofChina,Qingdao,p.11.

[5]Shen,Y.F.&Zhang,Z.S.1990.Modern biomonitoring techniques using fresh water microbiota.Publications/China Archiurf&Building Press,Beijing,p.275-286.

[6]Jiang,Y.L.,Lu,S.Z.&Shen,D.L.1996.Cellular biological experiment.publications/Fudan UniversityPress,Shanghai,p.16-17.

[7]Chen K.,Zhu,T.,Zhang,Y.T,et al.2009.Effect ofnitric oxide on N metabolism and Thylakoid membrane in Chlorella pyrenodosa response to UV-B radiation,Ecology and Environmental Sciences,Vol.18,p. 865-868.

[8]Bewley,T.D.1979.Physiological aspects of desiccation tolerance. Ann RevPlant Physiol.Vol.30,p.195-238.

[9]Srivastava,O.P.&Huystee,V.P.B.1973.Evidence for close association of POD polyphenol oxidase and IAA oxidase isoenzyme of peanut suspension culture medium.Can J Bot,Vol.51,p.2207-2215.

蔣美卿（1974—)，女，浙江東陽人，本科，工程師，主要從事工程設計、環境保護等方面的研究。