火針和毫針干預(yù)對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎模型大鼠的比較研究

曲圣元 陳荷清 車蕊 張明 劉柳青 馬文珠

·論著·

火針和毫針干預(yù)對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎模型大鼠的比較研究

曲圣元 陳荷清 車蕊 張明 劉柳青 馬文珠

目的 探究火針和毫針干預(yù)對(duì)于佐劑性關(guān)節(jié)炎模型大鼠的影響。方法 實(shí)驗(yàn)以佐劑性關(guān)節(jié)炎(AA)模型大鼠作為研究對(duì)象,將雄性Wistar大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,隨機(jī)分為空白對(duì)照組、火針組、毫針組、模型對(duì)照組,每組10只。每隔3天測(cè)量各組大鼠踝部腫脹情況、體質(zhì)量變化并進(jìn)行疼痛測(cè)量評(píng)定。在造模后第28天每組隨機(jī)處死2只大鼠,觀察左側(cè)踝關(guān)節(jié)組織切片和足三里部位組織切片。結(jié)果 40只大鼠均進(jìn)入結(jié)果分析。火針組、毫針組大鼠經(jīng)針刺后左踝直徑與模型對(duì)照組比較有顯著性降低(P＜0.05),關(guān)節(jié)疼痛評(píng)分與模型對(duì)照組比較也有顯著性降低(P＜0.05)。踝關(guān)節(jié)切片也可見局部組織炎性反應(yīng)得到改善,觀察足三里部位組織切片可見火針針刺可對(duì)肌肉組織造成損傷,但愈合較好。結(jié)論 火針和毫針干預(yù)對(duì)于佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠的癥狀改善有一定作用,兩種針刺方式對(duì)肌肉組織損傷較小且愈合良好。

針灸; 火針; 佐劑性關(guān)節(jié)炎模型

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與分組

雄性Wistar大鼠50只,體質(zhì)量(190±10)g,清潔級(jí),由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[許可證號(hào):SCXK(京)2012-0001],室溫(23±1)℃。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,將50只大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、造模組,其中空白對(duì)照組10只,造模組40只,將造模成功的30只大鼠隨機(jī)分為模型對(duì)照組、火針組、毫針組。實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)動(dòng)物的處置符合2006年科技部發(fā)布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》規(guī)定。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

完全弗氏佐劑(美國(guó)Sigma公司)、電子秤(北京健力園公司)、針灸針(華佗牌,0.30 mm×13 mm)、師氏火針(北京健樂康公司,0.5 mm×75 mm)、0.02游標(biāo)卡尺、半自動(dòng)輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)[(德國(guó)徠卡(Leica)儀器有限公司]、自動(dòng)化智能型正置研究級(jí)顯微鏡(奧林巴斯有限公司)。

1.3 模型制備

將造模組大鼠固定后暴露后肢,從大鼠左后足跖底部向踝關(guān)節(jié)方向注射完全弗氏佐劑0.1 mL[1],注射后6小時(shí)可見后爪紅腫,出現(xiàn)梭形趾,踝關(guān)節(jié)活動(dòng)受限,三足跛行,48小時(shí)可見全身多發(fā)性關(guān)節(jié)炎,表現(xiàn)為前后肢、耳部、尾部紅腫或炎性結(jié)節(jié),并出現(xiàn)體質(zhì)量下降和滑膜炎反應(yīng)的病理表現(xiàn)[2]。造模成功,其中30只大鼠造模穩(wěn)定,將其隨機(jī)分為模型對(duì)照組、火針組、毫針組,每組10只。空白組處理方法與其他組相同,僅以0.1 mL 0.9%氯化鈉溶液代替完全弗氏佐劑。

1.4 取穴

參照教材《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[3]的大鼠標(biāo)準(zhǔn)穴位圖譜定位取足三里穴、申脈穴。足三里穴:膝關(guān)節(jié)后外側(cè),腓骨小頭下約5 mm處。申脈穴:后肢外踝正下方凹陷中。

1.5 干預(yù)方法

空白對(duì)照組:將大鼠固定后,暴露后肢,不予以任何操作;模型對(duì)照組:將大鼠固定后,暴露后肢,不予以任何操作;火針組:造模后第6天,將大鼠固定,暴露后肢,用0.5 mm×75 mm細(xì)火針燒紅后迅速點(diǎn)刺左側(cè)足三里、申脈穴,點(diǎn)刺深度2 mm,3天治療一次,共治療7次;毫針組:造模后第6天,將大鼠固定,暴露后肢,用0.3 mm×13 mm毫針針刺左側(cè)足三里、申脈穴,留針20分鐘,3天治療一次,共治療7次。

1.6 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

(1)一般情況及體質(zhì)量測(cè)定:一般情況觀察各組大鼠活動(dòng)度、皮毛色澤、糞便、左側(cè)踝關(guān)節(jié)的變化;體質(zhì)量測(cè)定為造模日及開始治療后每隔3天測(cè)量各組大鼠體質(zhì)量。(2)踝關(guān)節(jié)直徑:測(cè)定大鼠左側(cè)踝關(guān)節(jié)外踝尖至內(nèi)踝尖距離。在每次治療前將大鼠固定后暴露后肢,用0.02 mm游標(biāo)卡尺外測(cè)量爪分別對(duì)準(zhǔn)大鼠左踝關(guān)節(jié)外踝尖與內(nèi)踝尖,讀數(shù)即為大鼠左側(cè)踝關(guān)節(jié)直徑。(3)關(guān)節(jié)疼痛評(píng)分測(cè)定:將大鼠固定后暴露后肢,穩(wěn)定10分鐘后進(jìn)行測(cè)定。緩慢屈伸大鼠左側(cè)踝關(guān)節(jié),10秒內(nèi)完成一次,共5

次。若大鼠無嘶叫或短促而明顯的縮腿反應(yīng)則評(píng)分為0;若出現(xiàn)嘶叫或短促而明顯的縮腿反應(yīng)則評(píng)分為1;嘶叫和短促而明顯的縮腿反應(yīng)兩種反應(yīng)均出現(xiàn)則評(píng)分為2[4]。(4)關(guān)節(jié)組織病理切片觀察:在造模后第28天,用10%水合氯醛(0.4 mL/100 g)腹腔麻醉后于腹主動(dòng)脈抽血處死。分離大鼠左側(cè)踝關(guān)節(jié),去除皮毛肌肉,分別在距關(guān)節(jié)兩側(cè)約0.3 cm處剪斷骨干,放入4%多聚甲醛固定、5.6% EDTA-2Na脫鈣后,進(jìn)行石蠟包埋、組織切片,常規(guī)HE染色,光鏡下觀察。(5)足三里部位切片觀察:大鼠麻醉處死后去除左側(cè)足三里部位皮毛,取1 cm×1 cm橫截面的肌肉,厚度約0.5 cm。4%多聚甲醛固定后,進(jìn)行石蠟包埋、組織切片,然后常規(guī)HE染色,光鏡下觀察。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。組間差異采用單因素方差分析,繼以LSD檢驗(yàn),以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠的一般情況及體質(zhì)量變化

(1)一般情況:空白對(duì)照組大鼠無明顯變化,各造模組與空白對(duì)照組相比,體質(zhì)量下降,精神萎靡,皮毛晦暗,糞便稀溏,活動(dòng)減少,三足跛行,有舔舐左后足行為。其踝關(guān)節(jié)6小時(shí)左右出現(xiàn)紅、腫、熱癥狀,但治療后各組與模型對(duì)照組相比,一般情況有所改善,進(jìn)食增加,便溏情況改善,活動(dòng)增加;(2)體質(zhì)量變化:各組大鼠在實(shí)驗(yàn)過程中體質(zhì)量變化均值總體呈上升趨勢(shì)。與空白對(duì)照組相比,造模后第6天各造模組大鼠體質(zhì)量均明顯下降(P＜0.05),造模后第21天火針組與空白對(duì)照組相比無顯著性差異,毫針組、模型組與空白對(duì)照組相比仍有差異(P＜0.05)。說明大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)受到造模影響而降低,造模成功。與模型對(duì)照組相比,火針組和毫針組大鼠體質(zhì)量并未有顯著性降低(P＞0.05)。

2.2 各組大鼠踝部直徑變化

各造模組大鼠在實(shí)驗(yàn)過程中左踝部直徑變化均值總體呈下降趨勢(shì)。與空白對(duì)照組相比,造模后大鼠左后足腫脹明顯,踝部直徑明顯增大,直至造模后第24天治療結(jié)束后各造模組踝直徑仍顯著性增加(P＜0.05),提示造模成功。與模型對(duì)照組相比較,從造模15天后開始,火針組和毫針組大鼠左踝顯著性降低(P＜0.05),但火針組與毫針組兩組間比較差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),說明火針及毫針治療對(duì)于AA大鼠踝部腫脹情況有所緩解,但治療24天后仍不能完全治愈,且兩種治療方式對(duì)于踝部腫脹改善并無明顯差異。

2.3 各組大鼠疼痛評(píng)分測(cè)定

各造模組與空白對(duì)照組大鼠相比,造模后大鼠屈伸疼痛評(píng)分顯著性增加(P＜0.05),提示造模成功。與模型對(duì)照組相比較,從造模后第18天開始,毫針組疼痛評(píng)分有顯著性降低(P＜0.05),造模后第24天火針組疼痛評(píng)分顯著性降低(P＜0.05),而兩組治療組組間比較無顯著性差異(P＞0.05),說明火針及毫針治療對(duì)于AA大鼠踝部腫脹情況有所緩解,治療24天后仍不能完全治愈,且毫針的緩解疼痛效果早于火針。空白對(duì)照組在造模第15天測(cè)定時(shí)組內(nèi)大鼠均未出現(xiàn)嘶叫或短促而明顯的縮腿反應(yīng),故數(shù)據(jù)為0。

2.4 關(guān)節(jié)組織病理切片觀察

空白對(duì)照組踝關(guān)節(jié)HE染色切片中可見軟骨面光滑,平整而清晰;軟骨細(xì)胞大小較為均勻清楚,細(xì)胞形態(tài)完整,排列有序,無明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn),也無新生小血管。模型對(duì)照組的踝關(guān)節(jié)切片中可見軟骨表面粗糙、不平整,部分出現(xiàn)剝脫;局部軟骨細(xì)胞發(fā)生凝固性壞死,軟骨細(xì)胞核發(fā)生固縮、碎裂、溶解,切片顯示有壞死殘留的無細(xì)胞區(qū);壞死灶周圍有部分軟骨細(xì)胞反應(yīng)性增生,形成排列紊亂的軟骨細(xì)胞團(tuán);局部組織中可見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)以及新生的小血管,提示造模成功。毫針組的踝關(guān)節(jié)切片則可見軟骨的表面較為光滑而連續(xù),稍有不平整;有局部軟骨組織發(fā)生壞死而形成點(diǎn)狀的紅染無細(xì)胞區(qū);在壞死組織周圍有軟骨細(xì)胞發(fā)生增生性反應(yīng),形成大小不等的軟骨細(xì)胞團(tuán);還有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。火針組的踝關(guān)節(jié)切片也可見軟骨的表面較為光滑,連續(xù),有部分不平整;此外切片顯示有部分軟骨組織壞死,存在點(diǎn)狀、片狀的紅染無細(xì)胞區(qū);還有軟骨細(xì)胞增生形成的大小不等的新生軟骨細(xì)胞,以及少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和新生的小血管,提示火針及毫針干預(yù)均能改善AA大鼠踝關(guān)節(jié)局部炎性反應(yīng),且兩種干預(yù)方式無顯著差異,見圖1。

2.5 足三里部位切片觀察

足三里穴位于脛骨前肌上,屬骨骼肌,空白對(duì)照組肌纖維排列整齊,少有分支,表面光滑;肌細(xì)胞核位于肌纖維周緣,呈橢圓形,核仁明顯;模型

組可見肌纖維排列略雜亂,肌纖維間界限較模糊,表面不光滑;散見少量紅細(xì)胞,分析認(rèn)為肌肉受造模影響,出現(xiàn)少量紅細(xì)胞可能與取材時(shí)操作有關(guān);毫針組肌纖維排列較整齊,表面較光滑,程度介于空白組和模型組之間;肌細(xì)胞核位于肌纖維周緣,呈橢圓形,核仁明顯;紅細(xì)胞極少,說明針刺對(duì)造模造成的肌肉損傷可能有緩解作用,且無明顯局部損傷;火針組可見肌纖維斷裂、扭曲,排列無規(guī)則;肌細(xì)胞核少見,位于肌纖維周緣,呈橢圓形,核仁明顯;肌纖維周圍可見肉芽組織:散見新生小毛細(xì)血管、大量成纖維細(xì)胞、炎性細(xì)胞浸潤(rùn),說明火針對(duì)于施針部位的局部組織有所損傷,但愈合良好,見圖2。

表1 各組大鼠不同時(shí)間平均體質(zhì)量測(cè)定結(jié)果

表2 各組大鼠不同時(shí)間平均左踝直徑測(cè)定結(jié)果

注:與空白對(duì)照組同期比較,aP＜0.05;與模型對(duì)照組同期比較,bP＜0.05;火針組與毫針組同期比較,cP＜0.05。

表3 各組大鼠不同時(shí)間平均疼痛評(píng)分測(cè)定結(jié)果

注:與空白對(duì)照組同期比較,aP＜0.05;與模型對(duì)照組同期比較,bP＜0.05。

圖2 各組大鼠足三里部位組織HE染色切片(×40)

3 討論

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎屬于中醫(yī)“痹癥”范疇,臨床中多選用患部局部及經(jīng)脈所過的臨近穴位[5]。申脈位于足太陽膀胱經(jīng),為八脈交會(huì)穴之一,通于陽蹺脈。

膀胱經(jīng)主一身之陽氣,且申脈為陽蹺所發(fā),可調(diào)一身之陽,運(yùn)行氣血,濡養(yǎng)肢節(jié),故善治療四肢疾患,尤以下肢疾患居多[6];足三里為胃經(jīng)之合穴,土經(jīng)之土穴,土屬中焦脾胃,能促進(jìn)機(jī)體的各種特異性和非特異性免疫功能[7]。《針灸大成·治癥總要》中提到腳弱無力先取“公孫、三里、絕骨、申脈”[8],故本實(shí)驗(yàn)選擇申脈、足三里穴兩穴。

本實(shí)驗(yàn)通過制備AA大鼠模型,測(cè)定各組大鼠體質(zhì)量、踝直徑、疼痛評(píng)分并觀察踝關(guān)節(jié)和針刺部位切片。研究結(jié)果顯示,與空白對(duì)照組相比,各造模組大鼠踝關(guān)節(jié)直徑相對(duì)增加,提示踝關(guān)節(jié)局部發(fā)生炎癥性出血,有血液成分滲出。造模后大鼠關(guān)節(jié)屈伸疼痛評(píng)分顯著性增加,說明局部的滲出物和炎性介質(zhì)作用于神經(jīng)末梢產(chǎn)生了炎癥性疼痛[3]。踝關(guān)節(jié)HE染色切片可見軟骨表面不平整、局部可見炎性細(xì)胞浸潤(rùn),其組織學(xué)特點(diǎn)與人類類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病理改變基本一致,說明本實(shí)驗(yàn)制備的慢性佐劑性關(guān)節(jié)模型復(fù)制獲得成功。與模型對(duì)照組相比,火針及毫針組大鼠一般情況有所改善,但體質(zhì)量并沒有顯著差異,說明體質(zhì)量尚不能作為判斷癥狀緩解的指標(biāo)。火針和毫針針刺后踝關(guān)節(jié)直徑降低,說明針刺干預(yù)對(duì)AA大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹有緩解作用,兩種方式無顯著性差異;火針及毫針干預(yù)后疼痛評(píng)分降低,說明針刺可以緩解疼痛癥狀,毫針的緩解疼痛效果早于火針,可能與火針造成肌肉損傷有關(guān)。毫針針刺后緩解疼痛癥狀,可能與激發(fā)了中樞神經(jīng)系統(tǒng)中鎮(zhèn)痛物質(zhì)而產(chǎn)生了調(diào)節(jié)功能有關(guān)[9],針刺后白介素1、白介素6、腫瘤壞死因子-α、β-內(nèi)啡肽等多種炎性介質(zhì)水平由異常升高趨向正常范圍,能促進(jìn)炎癥局部滲出物的吸收,減輕和消除炎癥水腫,抑制病變的進(jìn)展,從而減輕局部炎癥反應(yīng),同時(shí)針刺對(duì)于免疫紊亂炎癥反應(yīng)也有良性應(yīng)激作用[10],《靈樞·刺節(jié)真邪》曰:“用針之類,在于調(diào)氣”,針刺的雙向調(diào)節(jié)作用可以有利于治療疾病,達(dá)到“陰平陽秘,精神乃至”的狀態(tài)。對(duì)皮質(zhì)醇的分泌影響、對(duì)自由基的影響[11]、提高疼痛閾值也可能是針刺治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的機(jī)制。火針結(jié)合了毫針與艾灸療法,有消腫止痛、活血化瘀、化濕除痹的作用,火針點(diǎn)刺可以加快局部血液循環(huán),有消退關(guān)節(jié)腫脹疼痛的效果,文獻(xiàn)表明火針鎮(zhèn)痛后效應(yīng)可維持2～4小時(shí),長(zhǎng)于毫針針刺[2]。其治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的機(jī)制除了與毫針針刺重合之外,還可以加快新陳代謝速率、激活機(jī)體的應(yīng)激性反應(yīng)。但是相對(duì)于毫針針刺,火針可能留下燒傷痕跡和瘢痕,《針灸聚英》謂“切忌妄行火針于兩腳內(nèi)及足”,因此使用火針療法應(yīng)注意操作規(guī)范和使用禁忌。踝關(guān)節(jié)切片中可見軟骨表面較為光滑、稍有不平整,局部也可見少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、軟骨細(xì)胞增生,證明兩種干預(yù)方式對(duì)于佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠癥狀有所緩解,且無明顯差異。觀察足三里部位組織切片可見毫針組大鼠肌纖維較整齊,火針組肌纖維斷裂扭曲,排列無規(guī)則,可見成纖維細(xì)胞、炎性細(xì)胞浸潤(rùn),說明火針針刺可能對(duì)施針部位的局部組織有所損傷,但愈合良好。火針和毫針都是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎治療中的優(yōu)勢(shì)方案,在臨床中有更好的運(yùn)用前景,其治療機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究,使其在臨床中應(yīng)用更加完善。

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Comparative study of fire needle and filiform needle on adjuvant arthritis model rats

QU Shengyuan,CHEN He-qing,CHE Rui,et al. Institute of acupuncture and tuina,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China

MA Wen-zhu,E-mail:mawenzhu@139.com

Objective To explore and compare the influence of fire needle and filiform needle on adjuvant arthritis model rats.Methods Adjuvant arthritis(AA)model rats were used for this study.After the male Wistar rats were allowed to acclimate for 1 week,the rats were randomly divided into normal group,AA model group,acupuncture needle group,fire needle group,10 rats in each group.The swelling rate of ankle,weight,joint pain score of each group were measured every 3 days.28 days after the molding, 2 rats were sacrificed in each group randomly,the tissue section of the left ankle joint and“Zusanli”were observed.Results Totally 40 rates were involved in the result analysis.Compared with the model group, the left ankle diameter and joint pain score of the filiform needle and fire needle group were decreased significantly(P＜0.05).Pathology of the joint indicated that acupuncture has the effect of relieving the inflammation;pathology of“Zusanli”showed that fire needle may damage the muscle,but well healed. Conclusion Fire needle and filiform needle has a certain effects on improving the symptoms of adjuvant arthritis model rats,the two methods have small damage to the muscle and good healing..

Acupuncture; Fire needle; Adjuvant arthritis model

R245.3

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2016.11.006

2016-05-30)

(本文編輯:董歷華)

2015國(guó)家級(jí)創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目(201510026033)

100029 北京中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院[曲圣元(本科生)、陳荷清、車蕊、張明、劉柳青、馬文珠]

曲圣元(1994-),女,2012級(jí)在讀本科生。研究方向:影響針灸效應(yīng)相關(guān)參數(shù)的研究。E-mail: 497984361@qq.com

馬文珠(1960-),女,碩士,教授。研究方向:影響針灸效應(yīng)相關(guān)參數(shù)的研究。E-mail:mawenzhu@ 139.com