日本乙型腦炎病毒保護性抗原基因表達的研究

龍冬梅，黃 濤，湯德元，曾智勇，李 達，韋冠東

（貴州大學動物科學學院，貴州 貴陽 550025）

日本乙型腦炎病毒保護性抗原基因表達的研究

龍冬梅，黃 濤，湯德元*，曾智勇，李 達，韋冠東

（貴州大學動物科學學院，貴州 貴陽 550025）

日本乙型腦炎是由日本乙型腦炎病毒引起的嚴重的人畜共患性傳染病，日本乙型腦炎病毒的結構蛋白包括C、PrM和E 3種。其中C蛋白主要參與病毒RNA和蛋白之間的相互作用，且具有核定位信號序列，在乙腦病毒中，缺失此序列后C蛋白只在感染細胞的細胞質中出現；PrM和E基因是其主要免疫保護性抗原基因，表達的蛋白是乙型腦炎病毒的主要結構蛋白，是病毒顆粒的主要成分，也是維持病毒粒子形態結構的主要物質，主要參與病毒感染的后期階段，可誘導產生保護性免疫。近年來許多學者對日本乙型腦炎病毒保護性抗原基因原核表達和真核表達及其相關免疫原性進行了大量的研究，取得了一定的研究進展，文章主要針對日本乙型腦炎病毒保護性抗原基因表達的研究進展進行了綜述，為乙型腦炎基因工程疫苗的進一步研究提供參考。

日本乙型腦炎病毒；結構蛋白；原核表達；真核表達；免疫原性

日本乙型腦炎(Japanese encephalitis，JE)簡稱乙腦，是由乙型 腦炎病毒 (Japanese encephalitis virus，JEV) 引起的以三帶庫蚊為主要傳播媒介的嚴重的人畜共患傳染病。該病主要侵犯患病動物或人的丘腦、脊髓、角細胞、大腦皮質和小腦，引起患者中樞神經系統嚴重損傷。動物感染JEV的死亡率為30%，存活下來的有50%的動物會有神經系統的后遺癥［1］。世界衛生組織（WHO）已經把日本乙型腦炎列為重點防控傳染病。豬是乙型腦炎的主要傳染源，是引起母豬繁殖障礙的主要病原之一，對豬的致死率不高，臨床上以高熱和狂暴、或沉郁、意識障礙、抽搐、呼吸衰竭及腦膜刺激等神經癥狀為特征，具有明顯的季節性和一定的地理區域分布，多發生于蚊蟲較多的夏秋季節，屬于自然疫源性疾病，可引起懷孕母豬流產、死胎或木乃伊胎，也可引起公豬睪丸急性炎癥反應或不育，因此，控制豬的乙腦具有十分重要的意義。隨著科技工作者對JEV分子結構的大量研究，人們對JEV基因結構和基因表達的蛋白等都有了較為清楚的認識，為從分子水平上來研究JEV的防制奠定了理論基礎。在此基礎上，近年來許多學者對日本乙型腦炎病毒保護性抗原基因原核表達和真核表達及其相關免疫原性進行了大量的研究，取得了一定的研究進展，本文主要針對日本乙型腦炎病毒保護性抗原基因表達的研究進展進行了綜述，為乙型腦炎基因工程疫苗的進一步研究提供參考。

1 日本乙腦病毒的基因組結構

JEV的基因組為單股正鏈RNA分子，其長度為11 kb，與其他黃病毒科成員相似，整個基因組由非編碼區(5'-noncoding region， 5'-NCR )和3’端的非編碼區(3'-NCR)和一個幾乎跨越整個基因組的單一開放閱讀框(open reading frame， ORF)構成，無亞基因組結構。5'端有一個I型帽子結構，3’端無Poly ( A)尾，各基因之間無重疊。從5’端至3’端形成3個結構蛋白：核衣殼蛋白C(C)、膜蛋白( PrM/M )、囊膜糖蛋白(E)；7個非結構蛋白(NS1．NS2a．NS2b． NS3．NS4a．NS4b．NS5)，各基因在基因組上的排列為：5"-C-PrM/M-E-NSl-NS2a-NS2b-NS3-NS4a-NS4b-NS5-3"，它們之間無重疊，JEV基因組結構示意圖如圖1。

圖1 JEV基因結構示意圖

2 JEV蛋白的結構蛋白與功能

JEV有3種結構蛋白，分別是核衣殼蛋白(C)、膜蛋白(PrM/M)和囊膜糖蛋白(E)，這些結構蛋白是日本乙型腦炎病毒顆粒的主要成分，是維持病毒粒子形態結構的主要物質，編碼JEV結構蛋白的這些基因定位于ORF5’端約前1/3的部分，結構蛋白在N端順序依次為核衣殼蛋白C、膜蛋白PrM/ M和囊膜糖蛋白E，信號肽酶對此進行至少3次切割，將這些結構蛋白分開。JEV 3種結構蛋白的功能分別為：

2.1 核衣殼蛋白C

核衣殼蛋白C的分子量為13 ku，屬于強堿性蛋白，由136個氨基酸組成，其39～54位氨基酸序列在黃病毒屬中具有保護性，且該段氨基酸序列具有疏水性［2］。C蛋白的保守性稍差，主要作用為C蛋白與基因組RNA結合組成核心，參與病毒RNA和蛋白之間的相互作用，將其暫時固定在宿主細胞的內置網上，在病毒和衣殼裝配時發揮作用，作用是在合成部位由C端疏水性氨基酸將其暫時固定在宿主細胞的粗面內質網膜上，以便裝配成核衣殼包裹基因組，保護基因組免受核酸酶或其他因素的破壞。

2.2 M蛋白

M蛋白是由其前體PrM切割而產生，分子量為8．5 ku，約含有75個氨基酸殘基，具有高度的疏水性，參與病毒囊膜的構成，被包埋在病毒粒子囊膜的脂質雙層中，它可能與插入脂雙層中的E蛋白完全疏水性C端相互作用。其前體蛋白PrM(18～19 ku)存在于感染細胞內未成熟毒粒中，是未成熟病毒體的一部分，病毒以此與細胞相連。在病毒感染后期，可以誘導保護性免疫，PrM蛋白緊密地與E蛋白結合在一起，形成異二聚體，其作用認為是伴侶蛋白PrM對E蛋白的正確折疊、定位于膜上和最后的裝配起著至關重要的作用，是與膜結合以及裝配時所必須的，抑制病毒的作用直到病毒釋放。Takegami等［3］在對其生物學功能的研究中認為：M蛋白參與病毒的感染過程，能誘生具有輕度中和作用的抗體。PrM區整體結構相對較穩定［4］，是病毒誘發保護性免疫的重要協同成分，對E蛋白的正確折疊、定位于膜上和最后的裝配十分重要。

2.3 包膜蛋白E

E蛋白是JEV主要的囊膜蛋白，也是毒粒表面最重要的成分，在JEV毒力中占有重要位置，分子量為53 ku，含有病毒血凝素中和抗原決定簇，為黃病毒屬中的主要結構蛋白，是引起宿主機體免疫及產生中和抗體的主要抗原蛋白，它在參與病毒粒子的吸附、穿入、致病和誘導宿主的免疫應答等密切相關，在誘導機體產生有效的中和抗體及其保護性免疫中起重要作用［5］，并且是體外中和作用中的主要靶位點和JEV特異性抗體的作用位點，一般認為E蛋白是病毒受體的結合蛋白，介導膜融合和細胞傳入?；驗閱挝稽c突變可使JEV病毒喪失其神經毒力/侵襲力，通過對減毒株和野毒株的比較共有8個氨基酸殘基差異，具體位置在E107、E138、E176、E177、E264、E279、E315、E439位，是毒力減弱的關鍵位點，其中E138和E176位點上的氨基酸突變可能改變E蛋白對細胞受體的吸附性，或者引起該病毒對其他細胞不可穿透，這兩種機制導致病毒毒力減弱，即E蛋白138位點或138和176位點一起對乙型腦炎病毒強毒株在連續傳代過程中減弱起了關鍵作用［6］。同時E蛋白是體外中和作用的主要靶位點和JEV特異性抗體的作用位點，可激發中和抗體和保護性免疫。

3 日本乙型腦炎病毒保護性抗原表達及其免疫的研究進展

3.1 日本乙型腦炎的原核表達的研究進展

Mason等［7］己成功地在大腸桿菌中表達JEV的 E蛋白，對其進行單抗結合位點的研究。Konish等［8］用高度致弱的痘苗病毒NYVAC株分別構建了VP908和VP923；VP908表達PrM、E和NS1， VP923表達PrM和E，用VP908和VP923免疫豬，能明顯降低JEV強毒株攻擊后的病毒血癥。

Wu等［9］將JEVCH2195LA分離株的E蛋白這段目的基因克隆到原核表達載體pET32a，然后在大腸桿菌中表達融合蛋白TrxD3，用純化的蛋白與弗氏佐劑或陽離子脂質混合后免疫小鼠，結果證明：TrxD3融合蛋白能夠使小鼠產生較高的免疫保護中和抗體。

謝良伊［10］等根據GenBank數據庫中乙型腦炎病毒的PrM氨基酸序列獲得其對應的基因序列，對PrM全長基因（80aa）進行體外合成，將其克隆至Pet-21原核表達載體，構建重組表達質粒Pet21-PrM，將陽性重組質粒轉化大腸桿菌，IPTG誘導表達融合蛋白，通過鎳離子親和層析純化目的蛋白，將純化蛋白免疫BALB/c小鼠，獲取克隆抗體并利用Protein A Sepharose柱進行純化，然后用ELISA法檢測抗體的效價，再用Western bolt法檢測抗體的特異性，最后獲得了高純度的乙型腦炎病毒PrM蛋白，并成功地制定了效價高達1：1．6×106特異性的單克隆抗體。

梅勻安等［11］提取JEV上海分離株的基因組RNA，反轉錄合成cDNA，RT-PCR擴增該病毒的PrM基因片段，亞克隆到原核表達載體pET-28(a)上，構建重組質粒pET-28(a)-JEV-prM并轉化大腸桿菌BL21（DE3），挑取克隆擴大培養3 h后，1 mmol/LIPTG誘導3 h，分別在誘導前和誘導后取樣，煮沸裂解細菌，SDS-PAGE檢測重組蛋白表達情況，結果表明獲得分子量為24 ku的重組蛋白，主要以包涵體形式表達，薄層掃描分析表明：表達量占總菌體蛋白的30%以上，純化后獲得高純度重組蛋白，占總蛋白60%以上。用純化蛋白His-JEV-prM免疫BALB/ c小鼠，制備了小鼠抗JEV-prM抗體，Western-blotting和間接免疫熒光檢測小鼠抗JEV-PrM抗體的特異性。純化蛋白能誘導小鼠產生高滴度抗體，并且該抗體能特異識別原核、真核和病毒表達的PrM。

徐健等［12］和湯德元等［13］將收集到的JEV貴州分離株（GZ株）根據GenBank登錄的JEVSA14和SA14-14-2株全基因序列設計并合成1對擴增E基因的特異性引物，用RT-PCR方法擴增出JEV貴州分離株E基因，并將E基因克隆到pET-32a-E(+）原核表達載體上，成功地構建出了JEV的 E基因原核表達質粒pET-32a-E，將構建好的原核表達質粒轉化至宿主菌BL21(DH3）中，誘導表達目的蛋白，表達產物經SDS-PAGE電泳和Western blot分析，得到了約59 ku條帶，與預期大小相符，進一步提取、純化和濃縮目的蛋白，并將其加入弗氏佐劑后免疫小鼠，免疫后采血檢測抗體。結果顯示：JEV貴州分離株E基因原核表達目的蛋白能誘導小鼠產生一定抗體水平。

3.2 日本乙型腦炎病毒的真核表達的研究進展

Ashok M S等［14］構建了編碼JEV E蛋白的DNA質粒PCM XENV，經鼻腔和肌肉途徑接種瑞士小鼠后，進行JEV腦內接種攻擊試驗，結果顯示：該重組質粒對攻擊感染有一定的保護作用。

Chen等［15］利用真核表達載體分別重組構建了JEV E蛋白以及其他蛋白基因片段，通過比較上述重組質粒在分別免疫動物后所產生的中和抗體效價與免疫保護效果，發現含JEV E蛋白編碼基因的質粒DNA所致的中和抗體效價以及保護性免疫結果明顯優于其他蛋白基因片段，用編碼JEV E蛋白的質粒免疫小鼠，與活疫苗比較，結果產生了更持久更強的JEV E蛋白特異性抗體，且對JEV的致死具有高度保護性作用。

Konishi［16］利用DNA重組技術分別克隆了JEV E、C、NS1-2A、NS3以及NS5等蛋白編碼基因片段，發現含有JEV E蛋白編碼基因的質粒DNA所致的中和抗體效價以及保護性免疫結果明顯優于其他基因片段，說明含JEV E蛋白編碼基因的質粒DNA免疫結果與前述E蛋白功能分析相符合，在誘導機體產生中和抗體和保護性免疫方面起著主要作用。研究還發現：含JEV PrME蛋白編碼基因的重組質粒DNA在免疫動物后不僅誘導出特異性的CTL細胞免疫反應，而且還能產生特異性B細胞來參與體液反應，通過進一步研究還發現在免疫動物體內產生的中和抗體的效價與維持所需的時間都明顯高于普通滅活苗的免疫效果［17］。

Kour R等［18］用合成分泌型或膜錨定型JEV的P rM和E蛋白的質粒經肌注或基因槍接種小鼠發現：E蛋白的2種表達類型均能誘導較高的中和抗體滴度，而肌注較基因槍方法能誘導更高水平的抗E抗體反應；認為肌注可能誘導以Thl為主的免疫反應，而基因槍接種誘導Th2為主的免疫反應；在小鼠對JEV腦內接種的攻擊感染可提供60%的保護。

馮國和［19］等提取JEV野生株JaGAr-01感染培養的C6/36細胞的總RNA，經RT-PCR方法擴增出JEV prM/E與E基因片段，經電泳和核酸測序后分別將它們的蛋白編碼基因片段構建于真核表達載體pcDNA3的BamHI/EcoR I酶切位點之間，并分別將其命名為pJME和pJE。對培養后采用脂質轉染技術，選用HepG2、COS-1、KN73細胞作為受體細胞，將已構建的重組質粒pJME和pJE分別轉染于受體細胞，采用不同抗體系統，經Western blot法檢測JEV prME和E蛋白的表達特征，結果發現：在不同的細胞系內，PrM/ E蛋白的表達優于E蛋白。

4 對乙型腦炎病毒保護性抗原基因表達的展望

根據乙型腦炎病毒保護性基因的原核表達，抗原結合黃病毒C至E區段各結構蛋白功能特點分析，人們發現在prM和E蛋白編碼基因所進行的DNA疫苗具有一定的代表性。目前，國內外應用的乙腦疫苗主要有滅活疫苗和減毒疫苗2種。滅活疫苗主要是鼠腦純化滅活疫苗、和地鼠腎細胞滅活疫苗。鼠腦純化滅活疫苗是從感染鼠腦培養制備的，由日本研制生產并得到國際廣泛認可和使用的疫苗；地鼠腎細胞滅活疫苗為我國生產，病毒經原代地鼠腎細胞培養制備的疫苗，1998年開始生產使用，隨后在全國大面積使用。近幾年，Vero細胞純化滅活疫苗已在研究生產，該疫苗主要是我國自主研制的乙腦SA14-14-2株，為目前唯一獲得認可和推廣使用的乙腦活疫苗，自1989年獲得新藥證書以來，該疫苗產量不斷增多，并在全國廣泛使用，其弱毒性穩定并己經得到世界衛生組織的認可［20］；2000年曾明等對該減毒活疫苗進行了基因組全序列測定，證明了它傳代后的穩定性。隨著分子免疫學、分子生物學的迅猛發展和生物技術的進步和對JEV的分子生物學的大量研究，目前預防乙型腦炎病毒感染的疫苗有滅活疫苗和減毒活疫苗，但由于滅活疫苗存在注射量大，需要多次注射，且效果不穩定、免疫力不持久以及副作用大等缺點，所以減毒苗是一個更好的選擇；但是活疫苗畢竟是一種活的生物，所以我國研制的SA14-14-2株減毒活疫苗也會出現毒力返強、帶毒、排毒、垂直傳播和核酸重組等現象，而且通過常規的血清學方法一般無法與自然感染區分開，所以基因工程苗是乙腦疫苗發展的方向，國內外學者在嵌合病毒疫苗、DNA疫苗、蛋白質疫苗和亞病毒顆粒疫苗方面取得了一些進展。如用乙腦SA14-14-2病毒的PrM和包膜E蛋白基因代替17D黃熱病毒cDNA的相應序列，構建了嵌合的減毒乙腦疫苗，免疫鼠和猴子具有安全性、免疫原性和保護作用［20］?；蚬こ桃呙缬辛己玫陌l展前景，但有很多實際問題尚需解決。

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2016-01-28）

貴州大學引進人才科研項目（2015）。

龍冬梅（1990-），女，碩士研究生，主要從事動物傳染病病原分子病毒學的科研學習。

*通訊作者：湯德元（1964-），男，教授，博士，碩士生導師，主要從事動物傳染病病原分子生物學和中西獸醫結合的教學科研工作。E-mail：tdyuan@163.com