豬瘟、豬繁殖與呼吸綜合征、豬圓環(huán)病毒2型及鏈球菌混合感染的診斷

胡玲玲，湯德元，曾智勇，黃 濤，李 達(dá)，韋冠東，龍冬梅

( 貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025）

豬瘟、豬繁殖與呼吸綜合征、豬圓環(huán)病毒2型及鏈球菌混合感染的診斷

胡玲玲，湯德元*，曾智勇，黃 濤，李 達(dá)，韋冠東，龍冬梅

( 貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025）

2016年3月貴州省某規(guī)模化豬場的保育豬相繼出現(xiàn)四肢無力，趴地不能站立，叫聲嘶啞，死亡率高。經(jīng)臨床檢查和實(shí)驗(yàn)室診斷確診為豬瘟、豬繁殖與呼吸綜合征、豬圓環(huán)病毒2型和鏈球菌混合感染。現(xiàn)將診斷結(jié)果報(bào)道如下：

1 發(fā)病情況

該規(guī)模化豬場存欄豬1 000余頭，2016年3月中旬開始在2～3月齡保育豬出現(xiàn)發(fā)病，呈叫聲嘶啞、體溫升高、眼緣腫大、四肢無力、趴地不能站立，并不斷出現(xiàn)死亡現(xiàn)象；截止3月下旬共31頭豬發(fā)病，死亡18頭，另外13頭表現(xiàn)出相同的癥狀。

2 臨床癥狀

發(fā)病豬精神沉郁、食欲減退，消瘦，皮膚蒼白，叫聲嘶啞，體溫升高至40～41 ℃，四肢無力，走路搖晃，趴在地上不愿站立，外陰腫大，大腿內(nèi)側(cè)及腹部皮膚出現(xiàn)針尖狀出血點(diǎn)。發(fā)病特點(diǎn)為：發(fā)病急、病程短、死亡率高。初步懷疑為病毒性疾病和細(xì)菌性疾病混合感染。

3 病理剖檢變化

無菌剖檢病死豬的病理變化為：剖檢腹腔可見腸道嚴(yán)重充氣（圖1），腸系膜淋巴結(jié)部分腫大及充血，肝臟邊緣梗死（圖2），脾臟有大量瘀斑、邊緣呈鋸齒狀（圖3），胃底黏膜有出血、潰瘍灶（圖4）、心臟包膜有積液，肺部可見大量嚴(yán)重壞死病、嚴(yán)重充血、淤血（圖5），腸道黏膜出、充血現(xiàn)象明顯（圖6），膀胱黏膜有針尖大的出血點(diǎn)。

圖1 腸道充氣

圖2 肝臟邊緣梗死

圖3 脾臟邊緣鋸齒狀

圖4 胃黏膜潰瘍灶

圖5 肺部可見明顯充血、壞死

圖6 腸道出血

4 實(shí)驗(yàn)室診斷

4.1 細(xì)菌分離鑒定

4.1.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)

無菌條件下將病豬的血液、肺臟和肝分別接種于鮮血瓊脂培養(yǎng)基上，于37 ℃條件下需氧/厭氧培養(yǎng)24～72 h觀察。結(jié)果培養(yǎng)基在需氧和厭氧環(huán)境下均有菌落生成長，判定分離菌為兼性厭氧菌。細(xì)菌在普通營養(yǎng)瓊脂平板上生長貧瘠，培養(yǎng)24 h后有針尖大小的單個(gè)菌落出現(xiàn)。然后挑取單個(gè)菌落進(jìn)行純培養(yǎng)，同時(shí)對細(xì)菌進(jìn)行涂片、革蘭氏染色后經(jīng)1 000倍油鏡鏡檢有大量藍(lán)紫色圓形、雙球形或短鏈狀革蘭陽性球菌（圖7）。

圖7 10x100倍油鏡下可見單個(gè)或成鏈狀的球菌

4.1.2 生化鑒定

用杭州百思生物技術(shù)有限公司的BS7009球菌生化試劑盒檢測，結(jié)果表明：厭氧條件下培養(yǎng)的細(xì)菌對葡萄糖、蔗糖、果糖、覃糖、麥芽糖、甘露糖、蜜二糖、山梨醇以及N-乙酰葡胺試驗(yàn)呈陽性；木糖醇及硝酸鹽還原試驗(yàn)呈陰性；需氧條件下培養(yǎng)的細(xì)菌對蔗糖、蜜二糖、果糖試驗(yàn)呈陽性；麥芽糖、乳糖、甘露醇、甘露糖、木糖醇、山梨醇、覃糖、N-乙酰葡胺及硝酸鹽還原試驗(yàn)呈陰性；鑒定結(jié)果符合鏈球菌的生化特性。

表1 擴(kuò)增目的片段的引物

4.2??病毒核酸檢測

4.2.1 病料處理及DNA/RNA的提取

將送檢的死豬解剖分離各個(gè)器官，分別將心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟及淋巴結(jié)進(jìn)行取樣研磨，反復(fù)凍融3次，再用勻漿器進(jìn)行勻漿收集其勻漿液，再取其血液，10 000 r/min離心10 min取其上清液進(jìn)行DNA/RNA的提取，嚴(yán)格按照TaKaRa MinBEST Vira1 RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0說明書一步法提取DNA/RNA。

4.2.2 引物設(shè)計(jì)與合成

根 據(jù)GenBank中 登 錄 的PRV gB（AF257079）、PRVgE（JX417716）、PCV2 ORF2（NC_005148）、CSFV C（AY805221）、PRRSV ORF6(NC_001961)、PPV NS1(NC_001718) 和 SIV M(GU086140)等 基 因 序 列， 應(yīng) 用DNAStar、O1igo、MPprimer各設(shè)計(jì)了1對引物，用于擴(kuò)增目的基因片段，引物均由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司合成。引物序列見表1。

4.2.3 PCR/RT-PCR反應(yīng)

對提取的核酸分別進(jìn)行CSFV、PRRSV、PCV2、PRV、PPV和SIV的病原檢測，各反應(yīng)體系及條件如下：CSFV、PRRSV和PCV2反應(yīng)體系：2×1 Step Buffer 12.5 μL，Prime Script One Step Enzyme Mix 1 μL，上下游引物各1 μL，RNA模板2 μL，RNase Free H2O 7.5 μL， 總 體 積25 μL。反應(yīng)程序50 ℃ 40 min；94 ℃5 min；94 ℃30 s，56 ℃30 s，72 ℃30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。PRV反應(yīng)體系： 2×GC Buffer 12.5 μL，dNTPs (10 mmo1/L) 1.0 μL，上下游引物各1.0 μL，模板各2.0 μL， Taq DNA聚 合 酶 1.0 μL，RNase Free H2O 6.5 μL，總體積25 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃ 5 min；94 ℃ 1 min； 58 ℃ 1 min；72 ℃ 45 s； 35個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min。PPV和SIV反應(yīng)體系： 2×1 step buffer 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，模板3 μL，Prime Script One Step Enzyme Mix 1 μL，RNase Free H20 6.5 μL，總體積25 μL。PPV反應(yīng)程序95 ℃5 min；95 ℃30 s，57 ℃30 s，72 ℃30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min。SIV反應(yīng)程序50 ℃40 min；95 ℃5 min；95 ℃30 s，57 ℃30 s，72 ℃30 s，35個(gè) 循 環(huán)；72 ℃10 min。

圖8 PCR/RT-PCR檢測結(jié)果

4.2.4 PCR/RT-PCR檢測結(jié)果

各取5 μL PCR/RT-PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測。檢測結(jié)果如圖8所示：

如圖8所示檢測出豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒2型特異性病原核酸陽性條帶，測序結(jié)果與預(yù)期相符，確診為豬瘟、豬繁殖與呼吸綜合征、豬圓環(huán)病毒2型感染。

5 診斷結(jié)果

根據(jù)臨床典型癥狀，結(jié)合流行特點(diǎn)、病理剖檢和實(shí)驗(yàn)室細(xì)菌分離鑒定以病毒及PCR/RT-PCR檢測，確診該豬場豬發(fā)病原因?yàn)樨i瘟、豬繁殖與呼吸綜合征、豬圓環(huán)病毒2型和鏈球菌混合感染引起的發(fā)病死亡。

6 討論

隨著我國養(yǎng)豬業(yè)規(guī)模化、集約化的不斷發(fā)展及治療豬病手段的不斷進(jìn)步，隨之而來的疾病的種類也產(chǎn)生了變化，由以往的單一病原致病發(fā)展到多種病原混合感染和繼發(fā)感染。雖然藥物治療手段和效果越來越好，但隨之豬病的復(fù)雜程度及其危害也與日俱增。這對我們獸醫(yī)工作人員是一個(gè)極大的挑戰(zhàn)。CSFV和PRRSV是病毒性疫病的重要病原，CSFV、PRRSV能夠損傷機(jī)體的免疫系統(tǒng)，降低豬群對外界環(huán)境的抵抗力，使得豬群發(fā)生疾病時(shí)多種病原混合感染和繼發(fā)感染的情況越來越普遍，由于這些病毒給機(jī)體造成相似臨床癥狀，導(dǎo)致疾病的診斷十分困難，難以及時(shí)給予相應(yīng)的防治。目前在臨床上多見CSFV與其他病毒或細(xì)菌的混合感染使病情復(fù)雜，臨床上或不呈現(xiàn)典型癥狀，增大了臨床診斷的難度，同時(shí)也增大了豬群的發(fā)病率和死亡率，應(yīng)引起重視。

鏈球菌病是由鏈球菌感染引起的，我國部分省區(qū)時(shí)有發(fā)生。鏈球菌不僅可以侵入血液循環(huán)系統(tǒng)，而且可以穿過血腦屏障和胎盤屏障導(dǎo)致腦膜炎及母畜流產(chǎn)。在健康豬的體內(nèi)、血液循環(huán)系統(tǒng)、肝臟、腎臟、脾臟、腦脊液等器官和體腔內(nèi)是無病原體存在的，只有與外界相通的呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等有大量的微生物存在，當(dāng)豬所在環(huán)境條件差，如夏季溫度過高，濕度大，通風(fēng)不暢；冬天寒冷潮濕，溫差大；飼養(yǎng)管理不善，沒有規(guī)范的消毒措施，沒有嚴(yán)格的免疫程序，缺乏保健措施；以及飼料營養(yǎng)不平衡，有發(fā)霉變質(zhì)現(xiàn)象等，使豬機(jī)體處于應(yīng)激狀態(tài)，特異性、非特異性免疫反應(yīng)就會受到抑制，機(jī)體防御屏障被打破，從而容易受到病原體侵入，疾病進(jìn)入潛伏期或者表現(xiàn)出臨床癥狀，如果沒有及時(shí)改善不利因素同時(shí)做出對病情的診斷和治療，病原體會大量增殖，進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)，到達(dá)各臟器并造成損傷。

建議豬場做好環(huán)境衛(wèi)生消毒工作，首先對發(fā)病豬進(jìn)行隔離飼養(yǎng)；對檢測有PCV2感染的豬進(jìn)行淘汰；對病死豬進(jìn)行深埋或焚燒處理；對污染的圈舍和四周環(huán)境用2%的燒堿液進(jìn)行嚴(yán)格消毒。針對該規(guī)模化豬場出現(xiàn)PCV2的感染嚴(yán)重并出現(xiàn)仔豬死亡現(xiàn)象，該規(guī)模化豬場健康豬應(yīng)緊急接種豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗。待疫情穩(wěn)定1個(gè)月后，對豬場內(nèi)所有豬進(jìn)行豬瘟和豬藍(lán)耳病的常規(guī)免疫。

2016-09-08）

貴州省科學(xué)技術(shù)基金項(xiàng)目資助(黔科合J字［2013］2110號)；貴州省2014年農(nóng)業(yè)攻關(guān)項(xiàng)目資助(黔科合NY字［2014］3055號)

胡玲玲(1993-)，女，碩士研究生，主要從事動物傳染病病原分子生物學(xué)的科研學(xué)習(xí)

*通訊作者：湯德元（1964-），男，教授，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事動物傳染病病原分子生物學(xué)和中西獸醫(yī)結(jié)合的教學(xué)科研工作。E-mail：tdyuan@163.com