H2O2對流行性乙型腦炎的滅活效果研究

蔡雨函, 葉健強, 周遠成,3, 王 翱, 李 碧

(1. 畜禽生物制品四川省重點實驗室，四川 成都 610299；2.四川省畜牧科學研究院，四川 成都61066；3.四川華神獸用生物制品有限公司 四川省動物生物制品工程技術研究中心，四川 成都610299)

H2O2對流行性乙型腦炎的滅活效果研究

蔡雨函1,3, 葉健強1,2, 周遠成1,2,3, 王 翱1,3, 李 碧1,3

(1. 畜禽生物制品四川省重點實驗室，四川 成都 610299；2.四川省畜牧科學研究院，四川 成都61066；3.四川華神獸用生物制品有限公司 四川省動物生物制品工程技術研究中心，四川 成都610299)

流行性乙型腦炎是由日本腦炎病毒引起的，在自然界中主要以豬為宿主，經蚊為主的蟲媒傳播的一種人獸共患的嗜神經性急性傳染病。疫苗免疫是防控易感豬群乙型腦炎的主要措施，但國內尚無商品化豬流行性乙型腦炎滅活疫苗。滅活劑是影響滅活疫苗效果一個重要因素，研究通過先觀察過氧化氫酶催化分解H2O2的效果，然后利用TCID50方法結合PT-PCR方法檢測H2O2對JEV滅活效果。結果顯示當過氧化氫酶終濃度達到400 U/mL時，能夠將3% H2O2分解完全；3% H2O2滅活JEV 4 h能夠滅活完全，為以后評價JEV滅活苗的免疫效果提供數據支撐。

H2O2；流行性乙型腦炎；滅活

流行性乙型腦炎（Japanese encepha1itis， JE）又稱日本腦炎，簡稱乙腦，是由黃病毒科（F1aviviridae）黃病毒屬的重要成員日本腦炎病毒（Japanese encepha1itis virus， JEV）引起的一種人獸共患的蟲媒介導的嗜神經性急性傳染病。該病毒一般是通過豬一蚊一人的方式引起感染，人是JEV傳播途徑的終末宿主，由于豬感染后病毒血癥持續時間長，病毒效價較高，因此豬被認為是JEV最重要的擴增宿主和人類乙腦的主要傳染源之一［1］。該病毒感染豬后造成種豬繁殖障礙，嚴重制約養豬業的發展，同時也造成巨大的經濟損失。目前疫苗接種仍是控制乙腦流行最有效的方法，但國內尚無商品化豬流行性乙型腦炎滅活疫苗。

滅活劑是影響滅活疫苗效果的一個重要因素。甲醛是制備滅活疫苗最常用的滅活劑之一，但用于病毒滅活時會破壞關鍵的抗原表位導致免疫原性降低，甚至在某些情況下導致嚴重的疾病［2］。β-丙內酯是目前僅次于甲醛廣泛應用于疫苗研制的另一種滅活劑，但有研究發現，β-丙內酯滅活病毒制備的疫苗可能會導致免疫副反應，包括化學修飾疫苗抗原誘導過敏反應［3］。因此，研究新型、安全的病毒滅活劑對于研制高效的豬流行性乙型腦炎滅活疫苗具有重要價值。H2O2（過氧化氫，俗稱雙氧水）是一種高效的氧化劑，能快速地滅活RNA和DNA病毒，對抗原結構及免疫原性產生輕微的損傷，是目前最有潛力的病毒滅活劑。本研究探討H2O2滅活JEV的效果，為以后研究H2O2滅活JEV的免疫效果提供數據支撐。

1 材料與方法

1.1 病毒和細胞

JEV SC株由四川華神獸用生物制品有限公司重點實驗室分離并保存；BHK-21細胞由四川華神獸用生物制品有限公司重點實驗室保存。

1.2 主要試劑

DMEM、胎牛血清均購自GIPCO公司；96孔板購自Costar公 司；2×Taq PCR Master Mix、DNA Marker DL2000購自北京天根生化科技有限公司；TaKaRa RNAiso P1us、PrimeScript RT Kit購自大連寶生物工程有限公司；H2O2為國產分析純。

1.3 過氧化氫酶催化分解H2O2試驗

1.3.1 樣品制備將30% H2O2原液用含2% FBS DMEM培養液稀釋后，使H2O2終濃度為3%；然后加入不同體積H2O2酶，使其終濃度分別為50、100、200、300、400、500 U/mL，并設置未加入H2O2酶作為陰性對照，在室溫條件下放置20 min。

1.3.2 BHK-21細胞的制備取傳代后48 h的BHK-21細胞，觀察細胞匯合度達到90%以上，去除細胞培養液，用胰酶常規消化后，將細胞懸液加入到96孔板中，每孔加入100 μL，共7個96孔板，37 ℃，5% CO2培養24 h，使其細胞剛好鋪滿96孔板。

1.3.3 分解效果觀察

將處理好的含不同濃度H2O2酶的3% H2O2進行10倍倍比稀釋。具體方法如下：取1.5 mL離心管10個，分別編號1-10，在每個離心管中加入900 μL含2%FBS的DMEM。取樣品100 μL，加入到第一個離心管中，混勻后取100 μL到另外一個離心管中，以此方法稀釋至第10孔。將稀釋好的樣品（稀釋梯度從100～10-8）加入到96孔板中，每個梯度重復8孔（一列），每孔100 μL，并于第11列中加入100 μL含2%FBS的DMEM作為空白對照；然后置于37 ℃，5% CO2恒溫培養箱中培養3 d，并每天觀察記錄細胞生長狀態。

1.4 H2O2對JEV滅活效果的檢測

1.4.1 樣品制備

H2O2滅活JEV的方法為：將JEV SC株病毒液用30% H2O2原液稀釋后，使H2O2終濃度達到3%，置于4 ℃環境中，分別在滅活0、1、2、3、4、5、6、7、8、9 h后取出并加入1.3確定的H2O2酶濃度，然后在室溫條件下放置20 min。同時設立甲醛滅活JEV的陽性對照組及H2O2滅活JEV后未加入H2O2酶的陰性對照組。

甲醛滅活JEV的方法為：在JEV SC株病毒液中甲醛的體積分數為0.35%，在室溫條件下作用24 h，隨后在滅活病毒液中加入0.02%硫代硫酸鈉終止滅活，加入的量為每毫升加5 μL終止劑。

1.4.2 BHK-21細胞的制備

按照1.3.2方法制備BHK-21細胞，共12個96孔板，37 ℃，5% CO2培養24 h。

1.4.3 TCID50的測定

將處理好的H2O2滅活不同時間的JEV病毒液按照1.3.3方法進行10倍倍比稀釋。將稀釋好的樣品（稀釋梯度從100～10-8）加入到96孔板中，每個梯度重復8孔（一列），每孔100 μL，并于第11列中加入100 μL含2%FBS的DMEM作為空白對照；然后置37 ℃，5% CO2恒溫培養箱中培養3 d，觀察記錄細胞生長狀態，按Reed-Muench法計算病毒的TCID50并繪制滅活曲線。

1.4.4 RT-PCR檢測

觀察96孔板中細胞生長狀態，取H2O2完全滅活JEV時間段的樣品（即稀釋梯度為100），共8個孔，每2個孔（即共200 μL）收集在一個EP管中，分別編號為1-4，采用常規方法抽取RNA及按照試劑盒說明書反轉錄合成cDNA。采用20 μL體系進行PCR 反應，其中上下游引物（10 μmo1/L）各0.5 μL，2×Mix 10 μL，ddH2O 8 μL，cDNA 1 μL，反應條件為：95 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃延伸35 s，30個循環，最后72 ℃再延伸5 min。PCR 產物用 10 g/L瓊脂糖凝膠進行鑒定。引物序列如下：JEV-P1：5`-AAGTGTTTGGTGGTGCCTTC-3`，JEV-P2：5`-CCAAAGCAATTGATCGGTCT-3`，目的片段大小為120 bp。

2 實驗結果

2.1 H2O2酶催化分解H2O2試驗

通過觀察BHK-21細胞形態發現（見表1），當H2O2酶終濃度達到400 U/mL時，在室溫放置20 min內，H2O2酶能夠將H2O2分解完全。

表1 過氧化氫酶催化分解H2O2結果

2.2 病毒滅活曲線的繪制

根據TCID50方法繪制H2O2滅活JEV SC株的滅活曲線（見圖1），結果顯示3% H2O2滅活JEV 4 h滅活完全。

圖1 病毒滅活曲線

2.3 RT-PCR檢測結果

取在96孔板中培養3 d后用3% H2O2滅活JEV 4 h的病毒液（稀釋梯度為100）進行PT-PCR檢測，結果顯示（見圖2），編號1-4均未檢測出JEV陽性，而陽性對照出現目的條帶，表明3% H2O2滅活JEV 4 h能夠滅活完全。

圖2 RT-PCR檢測結果

3 討論

由于H2O2最終分解產生氧氣和水，不需要復雜的純化工藝即可將其從制備過程中去除，因此其獲美國FDA認證為一種環保化工試劑。而且許多研究證實H2O2滅活苗能夠產生高效的免疫保護，已用于滅活RNA和DNA病毒，包括淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒（1ymphocytic choriomeningitis virus， LCMV)，黃熱病病毒(ye11ow fever virus， YFV)，西尼羅病毒(West Ni1e virus ， WNV)，牛痘病毒(Vaccinia virus， VV)，猴 痘 病 毒 (monkeypox virus， MPV) 及 狂 犬 病 病 毒(rabies virus)［4-7］。這表明H2O2作為一種新型病毒滅活劑，具有很廣闊的應用前景。

特別指出的是，JEV與WNV具有高度的基因和蛋白同源性，H2O2滅活的WNV接種小鼠后能夠產生高滴度病毒特異的中和抗體，并完全保護小鼠抵抗致死性攻毒，因此應探討H2O2滅活JEV的效果，以及H2O2滅活JEV抗原在小鼠及豬體內的免疫效果，為新型豬流行性乙型腦炎滅活疫苗的研制提供參考數據。本研究利用TCID50方法結合PT-PCR方法檢測H2O2對JEV滅活效果，為以后評價JEV滅活苗的免疫效果奠定基礎。

過氧化氫酶能夠催化H2O2分解，為了保證在H2O2滅活病毒后H2O2能夠分解完全，不影響實驗結果的判定，本研究在H2O2滅活JEV后加入過氧化氫酶，以催化H2O2分解。在過氧化氫酶催化分解H2O2的試驗中，結果顯示，當過氧化氫酶終濃度達到400 U/mL時，接種細胞后細胞形態才能保持正常。

JEV滅活效果顯示，3% H2O2滅活JEV 4h滅活完全，接種細胞后細胞形態保持正常，以前有研究顯示1% H2O2滅活JEV 20 h才能滅活完全［8］，因此對比來看，在以后制備乙腦滅活疫苗過程中，選用3% H2O2滅活JEV，能夠大大節約時間成本。本研究還顯示2%甲醛37 ℃滅活病毒36 h滅活完全，甲醛滅活苗作用細胞后，細胞出現脫落，狀態變差，繼續傳代沒有檢測到JEV，可能是殘留的甲酸對細胞有毒性。這也表明H2O2相較于甲醛作為滅活劑的優勢，滅活產物沒有殘留，以此制備的滅活苗更安全穩定。

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2016-09-08)

四川省公益性科研院所基本科研項目（SASA2014A15）；四川省科技支撐計劃（2015NZ0105）

蔡雨函（1990-），女，四川南充人。

周遠成，博士，主要從事動物傳染病病原分子生物學研究