羊肚菌A1菌株菌絲體的培養特性*

周潔，譚偉**，曹雪蓮，2，苗人云，2，彭衛紅，黃忠乾，甘炳成

（1.四川省農業科學院土壤肥料研究所，四川成都610066；2.四川金地菌類有限責任公司，四川成都610066）

羊肚菌A1菌株菌絲體的培養特性*

周潔1，譚偉1**，曹雪蓮1，2，苗人云1，2，彭衛紅1，黃忠乾1，甘炳成1

（1.四川省農業科學院土壤肥料研究所，四川成都610066；2.四川金地菌類有限責任公司，四川成都610066）

設計8種碳源、8種氮源、6個梯度溫度和8個梯度pH值的試驗，對羊肚菌（Morchella importuna）A1菌株進行培養，觀察其菌落菌絲體生長勢和測定菌絲生長速度，比較分析其菌絲體最適培養特性。試驗結果表明，羊肚菌A1菌株菌絲體培養的最適碳源為甘露醇和阿拉伯糖，最適氮源為蛋白胨和(NH4)2SO4，最適溫度為15℃～25℃，最適pH值為4.5～5.5。

羊肚菌；菌絲體；碳源；氮源；溫度；pH值；生長勢；生長速度

羊肚菌（Morchella spp.）又名陽雀菌、羊肚菜等，是羊肚菌科羊肚菌屬所有種類的總稱，隸屬于菌物界（Fungi）子囊菌門（Ascomycota）盤菌綱（Discomycetes）盤菌亞綱（Pezizomycetidae）盤菌目（Pezizales）羊肚菌科（Morchellaceae）羊肚菌屬（Morchella）。羊肚菌營養豐富，味道鮮美，歐洲人認為是僅次于塊菌的美味食用菌，美國人視為“陸地之魚”[1]。羊肚菌又是重要的藥用菌，傳統中醫學認為，羊肚菌能益腸胃，化痰理氣，治療消化不良、痰多氣短[2]。

國內外諸多科技工作者開展羊肚菌研究工作已有100多年的歷史，并致力于能夠實現羊肚菌商業化栽培，但栽培試驗尤其是商業化栽培成功的報道并不多見。筆者所在四川省農業科學院微生物研究室和金地菌類公司合作，近幾年已經成功地在室外大田實現羊肚菌栽培，但是，仍然覺得存在著重現性不甚理想的情況，需要深入了解羊肚菌生物學特性，以提高其栽培穩定性。

黃年來[3]介紹了國外學者T.N.Kaul等的羊肚菌培養特性。陳慧群（1995）[4]，王秀云（1998）[5]，董愛榮、桂明英、張松（2002）[6-8]，努爾古麗·阿布都熱合曼、趙春燕、陳芳草（2004）[9-11]、彭璐、任桂梅（2006）[12-13]、柴林山（2010）[14]、朱永真（2011）[15]、謝放（2014）[16]等先后對羊肚菌的生物學特性或生態特性做了試驗研究。筆者對本研究所微生物研究室采集、分離和保存的羊肚菌A1菌株進行了菌絲體培養的試驗研究，以深入了解其菌絲體生長特性。

1　材料和方法

1.1供試菌株

供試羊肚菌菌株A1菌株（Morchella importuna M.Kuo,O'Donnell&T.J.Volk），來源于四川省農科院土壤肥料研究所微生物研究室。

1.2培養基

1.2.1馬鈴薯葡萄糖培養基

馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、磷酸二氫鉀0.5 g、硫酸鎂0.5 g、維生素B110 mg、瓊脂25 g，蒸餾水1 000 mL。該培養基用于活化菌株。

1.2.2葡萄糖蛋白胨培養基

葡萄糖20 g、蛋白胨2 g、磷酸二氫鉀0.5 g、硫酸鎂0.5 g、維生素B110 mg、瓊脂25 g，蒸餾水1 000 mL。

1.3試驗處理設計

1.3.1碳源試驗

將1.2.2葡萄糖蛋白胨培養基作為碳源試驗的基礎培養基，分別以20 g的阿拉伯糖、乳糖、甘露醇、丙三醇、蔗糖、麥芽糖和淀粉7種碳源，替換碳源基礎培養基配方中的20 g葡萄糖，同時，以不加碳源設置對照（CK），制作成9種培養基（含CK），即共設計成9個處理的碳源試驗，每個處理設3次重復。

1.3.2氮源試驗

將1.2.2葡萄糖蛋白胨培養基作為氮源試驗的基礎培養基，分別以2 g的KNO3、NaNO2、NH4Cl、(NH4)2SO4、尿素、麥芽浸粉和天冬酰胺7種碳源，替換氮源基礎培養基配方中的2 g蛋白胨，同時，以不加氮源設置對照（CK），分別制作成9種平板培養基，即共設計成9個處理（含CK）的氮源試驗，每個處理設3次重復。

1.3.3溫度試驗

使用1.2.2葡萄糖蛋白胨培養基，分別在10℃、15℃、20℃、25℃、30℃和35℃共6個溫度條件下培養供試菌株，即共設計成6個處理的溫度試驗，每個處理設3次重復。

1.3.4pH試驗

采用0.1 mol·L-1檸檬酸、0.2 mol·L-1磷酸二氫鈉緩沖液和1 mol·L-1氫氧化鈉溶液，分別將1.2.2葡萄糖蛋白胨培養基調節成pH為4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5和8.0的培養基，共計8種培養基，即共設計成8個處理的pH值試驗，每個處理3次重復。

1.4試驗方法

1.4.1使用平板培養基

1.3中碳源、氮源、溫度和pH值試驗的培養基均按照常規方法制作，各個試驗用培養基均勻地分裝于直徑9 cm規格的平皿中進行試驗。

1.4.2試驗觀測方法

無菌操作，將A1菌株種塊接種于平板培養基表面正中央位置，之后在（25±1）℃培養箱（溫度試驗按照設計溫度梯度進行）中避光培養，每個處理重復3次。

觀察A1菌株在各個試驗處理上的菌落生長勢，主要觀察菌絲生長濃密程度和菌絲爬壁力情況。

測定菌絲生長速度，菌株菌絲生長速度以菌落生長半徑來表示（即菌絲體在平板培養基上直線生長的有效距離）。

菌落半徑的測定：在裝有培養基的平皿外表面，以中心為基點畫兩條垂直直線，沿直線方向測量從接種塊邊緣至菌落邊緣的距離，即菌落生長半徑長度。

1.5數據分析

試驗數據用SPSS 17.0統計分析軟件進行分析。

2　結果與分析

2.1碳源對菌絲生長的影響

羊肚菌A1菌株在供試9種碳源培養基上的培養試驗結果表明，其菌絲都能夠生長，但濃密程度、爬壁能力有差異。菌絲生長的濃密程度：除了不添加碳源培養基（CK）上的菌絲生長表現為較濃密之外，其余碳源培養基上菌絲生長都濃密；菌絲生長的爬壁能力：在葡萄糖、CK和麥芽糖培養基上菌絲生長的爬壁力較強，在阿拉伯糖、乳糖、甘露醇、丙三醇和蔗糖培養基上菌絲生長的爬壁力強，在淀粉培養基上菌絲生長的爬壁力很強。而且還觀察到在阿拉伯糖、甘露糖和淀粉培養基上菌絲生長有變銹色情況發生。雖然本研究用的阿拉伯糖碳源培養基本身有顏色，但是阿拉伯糖培養基上的菌絲面顏色最深（圖1、表1）。結果說明，不同碳源對羊肚菌A1菌株的菌絲生長勢有不同程度的影響。

圖1　羊肚菌A1菌株在不同碳源培養基上菌絲生長勢Fig.1Growth vigour of tested stain mycelium in different carbon sources

表1　不同碳源對羊肚菌A1菌株菌絲生長的影響Tab.1Effect of different carbon sources on the growth of Morchella importuna stain A1 mycelium

由表1試驗結果數據可知，羊肚菌A1菌株在供試9種碳源培養基上的菌絲生長速度范圍為11.9 mm·d-1～15.6 mm·d-1，其菌絲日均生長速度由慢至快順序依次為蔗糖（11.9 mm·d-1）＜CK（13.4 mm·d-1）＜葡萄糖（13.7 mm·d-1）＜麥芽糖（14.1 mm·d-1）＜淀粉（14.4 mm·d-1）＜丙三醇（14.6 mm·d-1）＜阿拉伯糖（15.5 mm·d-1）=乳糖（15.5 mm·d-1）＜甘露醇（15.6 mm·d-1），在蔗糖培養基上菌絲生長最慢（11.9 mm·d-1），在甘露醇培養基上菌絲生長最快（15.6 mm·d-1）。其中，甘露醇、阿拉伯糖和乳糖培養基的菌絲生長速度之間無極顯著差異，但與其它碳源培養基的菌絲生長速度間達到極顯著差異。試驗結果說明，不同碳源對羊肚菌A1菌株的菌絲生長速度有不同程度的影響。相比之下，含有甘露醇和阿拉伯糖2種碳源的培養基是其菌絲生長速度最快的培養基，加之，這兩種碳源培養基上菌株菌絲生長勢好（菌絲生長濃密、爬壁力強），因此認為，甘露醇和阿拉伯糖這兩種碳源是羊肚菌A1菌株菌絲生長的最適碳源。

2.2氮源對菌絲生長的影響

羊肚菌A1菌株在供試9種氮源培養基上培養試驗結果表明，其菌絲都能夠生長，但是，觀察到其菌絲生長的濃密程度和爬壁能力有差異。其中，在尿素培養基上菌絲生長很濃密和爬壁力很強，而且菌絲生長變為的銹色面大（圖2、表2）。結果說明，不同氮源對羊肚菌A1菌株的菌絲生長勢有不同程度的影響。

圖2　羊肚菌A1菌株在(NH4)2SO4、蛋白胨和尿素3種氮源培養基上菌絲生長勢Fig.2Growth vigour of Morchella importuna stain A1 myceliun in(NH4)2SO4,peptone and urea

由表2可知，A1菌株在供試9種碳源培養基上的菌絲生長速度范圍為7.5 mm·d-1～15.5 mm·d-1，其菌絲日均生長速度由慢至快順序依次為尿素（7.5 mm·d-1）＜NaNO2（11.1 mm·d-1）＜NH4Cl（12.4 mm·d-1）＜KNO3（12.7 mm·d-1）＜天冬酰胺（13.7 mm·d-1）＜CK（14.6 mm·d-1）＜蛋白胨（14.8 mm·d-1）=麥芽浸粉（14.8 mm·d-1）＜（NH4）2SO4（15.5 mm·d-1），在尿素培養基上菌絲生長最慢（7.5 mm·d-1），在(NH4)2SO4培養基上菌絲生長最快（15.5 mm·d-1）。其中，在蛋白胨、麥芽浸粉、CK和(NH4)2SO4這四種氮源培養基上菌絲生長速度之間無極顯著差異，但與其它氮源培養基的菌絲生長速度相比達到極顯著差異。試驗結果說明，不同氮源對羊肚菌A1菌株的菌絲生長速度有不同程度的影響。相比之下，含有蛋白胨和(NH4)2SO4兩種氮源的培養基是其菌絲生長速度最快的培養基，加之，這兩種氮源培養基上菌絲生長勢好（菌絲生長濃密、爬壁力強）。這表明，蛋白胨和(NH4)2SO4兩種氮源是羊肚菌A1菌株菌絲生長的最適氮源。

2.3溫度對菌絲生長的影響

不同溫度對羊肚菌A1菌株菌絲生長的影響情況見表3。

表2　不同氮源對羊肚菌A1菌株菌絲生長的影響Tab.2Effect of different nitrogen sources on the growth of Morchella importuna stain A1 mycelium

表3　不同溫度對羊肚菌A1菌株菌絲生長的影響Tab.3Effect of different temperature on the growth of Morchella importuna stain A1 mycelium

由表3可知，A1菌株在6個溫度梯度下培養，其菌絲生長速度范圍為3.5 mm·d-1～17.9 mm·d-1，菌絲日均生長速度由慢至快順序依次為30℃（3.5 mm· d-1）＜10℃（5.0 mm·d-1）＜35℃（5.1 mm·d-1）＜15℃（11.6 mm·d-1）＜20℃（15.3 mm·d-1）＜25℃（17.9 mm·d-1），菌株在30℃溫度下菌絲生長速度最慢（3.5 mm·d-1），25℃溫度下菌絲生長速度最快（17.9 mm· d-1）。其中，20℃和25℃溫度下菌絲生長速度之間無極顯著差異，但與其它溫度梯度下菌絲生長速度相比達到極顯著差異。結果表明，溫度15℃～25℃是羊肚菌A1菌株菌絲生長的最適培養溫度。

2.4pH值對菌絲生長的影響

在pH值試驗中，隨著pH值上升培養基顏色也加深，所以本試驗中pH值7.5和8.0顯示的是培養基本身的顏色（圖3）。

圖3　羊肚菌A1菌株在不同pH值培養基上菌絲生長勢Fig.3Growth vigour of Morchella importuna stain A1 myceliun in different pH

羊肚菌A1菌株在供試8個梯度pH值下培養試驗結果表明，其菌絲都能夠生長，但是，觀察到其菌絲生長的濃密度及爬壁能力有所差異。在pH值5.0、6.0、6.5和7.0下菌絲變銹色（圖3、表4）。結果說明，不同碳源對羊肚菌A1菌株的菌絲生長勢有不同程度的影響。

由表4可見，A1菌株在8個pH值下培養，其菌絲生長速度范圍為1.1 mm·d-1～11.7 mm·d-1，其菌絲日均生長速度由慢至快順序依次為pH 8（1.1 mm·d-1）＜pH 7.5（4.8 mm·d-1）＜pH 7.0（8.1 mm·d-1）＜pH 6.5（9.2 mm·d-1）＜pH 6.0（10.5 mm·d-1）＜pH 5.0（11.3 mm·d-1）＜pH 5.5（11.4 mm·d-1）＜pH 4.5（11.7 mm·d-1），pH為8條件下菌絲生長速度最慢（1.1 mm·d-1），pH值4.5條件下菌絲生長速度最快（11.7 mm·d-1）。其中，pH值4.5、5.0和5.5條件下菌絲生長速度間無極顯著差異，但與其它pH值梯度下菌絲生長速度相比達到極顯著差異。結果表明，培養基pH值4.5～5.5是羊肚菌A1菌株菌絲生長的最適培養pH值。

表4　不同pH值對羊肚菌A1菌株菌絲生長的影響Tab.4Effect of different pH on the growth of Morchella importuna stain A1 mycelium

表5　幾種羊肚菌最適培養條件的比較Tab.5Comparison on optimal culture conditions of the Morchella

3　小結與討論

3.1羊肚菌A1菌株培養特性

本試驗結果表明，羊肚菌A1菌株菌絲體培養的最適碳源為甘露醇和阿拉伯糖，最適氮源為蛋白胨和(NH4)2SO4，最適溫度為15℃～25℃，最適pH值為4.5～5.5。

3.2羊肚菌特性因菌株而異

筆者將本試驗研究結果與其他學者關于羊肚菌培養的主要研究結果進行比較（表5）認為，羊肚菌的培養特性因菌株不同而不同。這與廣義羊肚菌指羊肚菌屬[1]，屬內有多個種，種中又有不同菌株密切相關。根據杜習慧等[17]文獻，目前已知羊肚菌屬有61個種，東亞或中國分布了該屬近一半的物種（30種），歐洲分布有23種，北美分布有19種。物種及種內菌株的分布地域不同，菌株長期適應當地環境條件，形成了菌株自身的種性特點。

3.2.1最適碳源

本試驗結果表明供試菌株A1菌絲體培養的最適碳源為甘露醇和阿拉伯糖，與其他人的結果有所不同：如董愛榮研究的最適碳源為蔗糖[6]，張松和朱永真研究的最適碳源為淀粉[8，15]，陳芳草研究的最適碳源為葡萄糖、蔗糖[11]，趙春燕[10]、彭璐[12]、任桂梅[13]和柴林山[14]研究的最適碳源為葡萄糖，謝放[16]研究的最適碳源分別為葡萄糖、麥芽糖、淀粉（因菌株而異）。

3.2.2最適氮源

本試驗結果表明供試菌株A1菌絲體培養的最適氮源為蛋白胨和（NH4）2SO4。其中的蛋白胨結果與張松[8]、陳芳草[11]、彭璐[12]和謝放[16]等的結果相一致。

3.2.3最適溫度

本試驗結果表明供試菌株A1菌絲體培養的最適溫度為15℃～25℃。這與陳慧群[4]研究的22～24℃、趙春燕[10]研究的24℃相近，與王秀云[5]、董愛榮[6]、彭璐[12]、柴林山[14]和謝放[16]研究的25℃結果吻合，而與陳芳草[11]研究的15℃～20℃相同。

3.2.4最適pH

本試驗結果表明供試菌株A1菌絲體培養的最適pH值為4.5～5.5。這個結果的上限值pH值5.5與董愛榮[6]研究的pH值5.0～6.0和陳芳草[11]研究的pH值5.0～7.0的部分結果相同。與其他人的結果不一致，如陳慧群[4]研究的pH值7.0～7.5，王秀云[5]研究的pH值7.0，張松[8]研究的pH值6.0～7.0，趙春燕[10]和柴林山[14]研究的pH值7.5，謝放[16]研究的pH值6.0～8.0。

[1]黃年來，林志彬，陳國良，等.中國食藥用菌學[M].上海：上海科學技術文獻出版社，2010：1375-1396.

[2]劉波.中國藥用真菌[M].太原：上山西人民出版社，1974：23-27.

[3]Kaul TN，黃年來.羊肚菌的培養研究[J].食用菌，1984（3）：49-50.

[4]陳慧群，劉洪玉.尖頂羊肚菌生物學特性的研究[J].食用菌，1995（5）：18-19.

[5]王秀云.尖頂羊肚菌生物學特性的研究[J].食用菌，1998（1）：13-14.

[6]董愛榮，吳慶禹，何力，等.羊肚菌的生物學特性[J].東北林業大學學報，2002，30（4）：28-30.

[7]桂明英，朱萍，郭永紅，等.尖頂羊肚菌生物學特性初步研究[J].中國野生植物資源，2002，21（3）：7-10.

[8]張松，夏艷紅，姚珍平.羊肚菌菌絲生物學特性研究[J].食用菌學報，2002（1）：18-21.

[9]努爾古麗·阿布都熱合曼.新疆羊肚菌的生物學特性研究[D].烏魯木齊：新疆農業大學，2004：12-16.

[10]趙春燕，孫軍德，李敏，等.培養條件對羊肚菌菌絲生長的影響[J].中國食用菌，2004，24（1）：15-17.

[11]陳芳草，劉興蓉，譚方河，等.尖頂羊肚菌生物培養特性研究[J].西南農業學報，2004，17（4）：508-513.

[12]彭璐，常繼東.羊肚菌菌絲培養特性的研究[J].食用菌，2006（5）：10-12.

[13]任桂梅，賀曉龍，路敏.羊肚菌M延-5菌株菌絲體生長所需碳氮源的研究[J].安徽農業科學，2006，34（13）：2947-2948，2951.

[14]柴林山，李莉，冀北贏，等.羊肚菌LWY-1生物學特性的研究[J].食用菌，2010（1）：12-14.

[15]朱永真，杜雙田，車進，等.不同碳源與氮源對羊肚菌菌絲的影響[J].西北農林科技大學，2011，39（3）：113-118.

[16]謝放，吳萍民，趙春巧.7株羊肚菌菌絲的生物學特性研究[J].中國農學通報，2014，30（10）：140-147.

[17]杜習慧，趙琪，楊祝良.羊肚菌的多樣性、演化歷史及栽培研究進展[J].菌物學報，2014，33（2）：183-197.

Mycelium Cultivation Characteristics of Morchella importuna A1 strain

ZHOU Jie1,TAN Wei1,CAO Xue-lian1,2,MIAO Ren-yun1,2,PENG Wei-hong1, HUANG Zhong-qian1,GAN Bing-cheng1
(1.Soil and Fertilizer Institute,Sichuan Academy of Agricultural Sciences,Chengdu 610066,China; 2.Sichuan Jindi Fungus Co.Ltd.,Chengdu 610066,China)

Eight carbon sources,eight nitrogen sources,six gradient temperatures and eight pH to culture mycelium of Morchella importuna A1 strain were devised.The cultivation characteristics of growth vigour and growth rate were analyzed.The results revealed that the optimal cultural characteristics of A1 mycelium under the below condition were gained,such as mannitol and arabinose as the best carbon sources,peptone and(NH4)2SO4as the best nitrogen sources,temperature between 15℃to 25℃, pH between 4.5 and 5.5.

Morchella;mycelium;carbon source;nitrogen source;temperature;pH;growth vigor;growth rate

S646.9

A

1003-8310（2016）04-0012-06

四川省財政創新能力提升工程項目（青年基金）（2013QNJJ-017）。

周潔（1983-），女，碩士，助理研究員，主要從事食用菌遺傳育種研究。E-mail:caoqianyou88@qq.com

**通信作者：譚偉（1964-），男，碩士，研究員，主要從事主要從事食用菌育種與栽培研究。E-mail:332528058@qq.com

2016-05-15