浙江省余姚地區22個非綜合征型耳聾家系遺傳分析

彭光華，王輝，姚娟，范文露，唐霄雯，鄭斌嬌，薛凌，呂建新，管敏鑫，3

（1.余姚市人民醫院 耳鼻咽喉科，浙江 寧波 315400；2.溫州醫科大學 Attardi線粒體生物醫學研究院，浙江 溫州 325035；3.浙江大學 遺傳研究所，浙江 杭州 310058）

浙江省余姚地區22個非綜合征型耳聾家系遺傳分析

彭光華1，2，王輝2，姚娟2，范文露2，唐霄雯2，鄭斌嬌2，薛凌2，呂建新2，管敏鑫2，3

（1.余姚市人民醫院 耳鼻咽喉科，浙江 寧波 315400；2.溫州醫科大學 Attardi線粒體生物醫學研究院，浙江 溫州 325035；3.浙江大學 遺傳研究所，浙江 杭州 310058）

目的：對寧波市余姚地區22個非綜合征型耳聾（NSHI）家系GJB2、GJB3、GJB6編碼區以及線粒體基因突變分析，進行臨床、遺傳和分子特征分析評估。方法：調查對象來自于余姚市人民醫院22個NSHI家系22名先證者及患病家屬33名，聽力正常者254例，且均未攜帶GJB2、GJB3、GJB6編碼區以及線粒體基因致病突變。所有受檢者均采集外周血并提取DNA，并對受檢者GJB2、GJB3、GJB6基因編碼區以及線粒體基因進行測序，結合患者聽力學檢查、耳聾相關突變熱點基因檢測以及患者家系資料進行綜合遺傳分析。結果：在來源于寧波市余姚地區的22個NSHI家系的33名患者中，發現攜帶有GJB2基因235delC單突變家系4例，GJB2雙雜合突變家系2例，線粒體基因1555位點突變3例。在GJB3、GJB6編碼區并未發現有致病突變。在這22個NSHI患者家系中，有27.3%的家系檢測出攜帶有GJB2基因病理性突變；有13.6%的家系攜帶有線粒體12S rRNA基因1555A＞G突變。據臨床資料顯示，6個攜帶GJB2基因病理性突變家系以及3個攜帶1555A＞G突變家系的聽力損失程度、發病年齡、耳聾外顯率等都有差異。結論：GJB2基因以及線粒體12S rRNA基因1555A＞G突變是浙江省余姚地區NSHI患者的主要相關基因，可能也存在其他未知基因與這2個基因相互協同作用，對患者表型產生影響。

非綜合征型耳聾；GJB2；線粒體DNA；基因突變

耳聾是人類感覺系統障礙最常見的疾病之一，每500個嬰兒中就有一個發生先天性聽力損失或語前聾[1]。其中，80%的患者除耳聾外不伴有其他癥狀，稱為非綜合征型耳聾（nonsyndromic hearing impairment，NSHI）。50%以上的耳聾是由遺傳因素造成的，遺傳方式包括常染色體顯性遺傳、常染色體隱性遺傳、X-連鎖以及母系遺傳等[2]。GJB2基因異常被公認為遺傳性聾最常見的病因，能導致常染色體顯性和隱性NSHI，約占遺傳性NSHI的50%[3]，GJB3、GJB6 突變也可以引起耳聾[4-5]。GJB2基因編碼縫隙連接蛋白-26（connexin-26，Cx-26），當發生病理突變時，表達出結構不正常的Cx-26，縫隙連接受損，鉀離子回流進入內淋巴液的循環受到影響，導致Corti氏器的鉀離子中毒從而引起感音神經性耳聾[6]。線粒體DNA（mito-chondrial DNA，mtDNA）突變是母系遺傳性耳聾重要的分子遺傳基礎，而線粒體12S rRNA基因上的A1555G、C1494T以及tRNASer(UCN)基因上的A7445G、G7444A、7472insC、T7510C和T7511C均是與NSHI相關的熱點突變[7-10]。

1 對象和方法

1.1 研究對象 本研究對象來自于余姚市人民醫院耳鼻喉頭頸外科門診，所有患者臨床資料以及外周血樣采集均依據溫州醫科大學倫理委員會管理規定執行。對患者進行了詳細的發病史調查和體格檢查，確定患者是否具有其他臨床表型、氨基糖甙類藥物（AmAn）用藥史以及是否有噪聲接觸史等其他導致耳聾的環境因素。對照組來源于課題組收集的聽力正常人群樣本254例。

1.2 方法

1.2.1 臨床檢查：本課題采用的聽力學檢查主要以純音測聽（pure tone audiometry，PTA）來判定患者聽力損失程度（主要包括PTA、ABR、聲阻抗及 DPOAE）。以聽力水平的分貝（dB）值為單位記錄PTA結果，并以頻率500、1 000、2 000、4 000和8 000 Hz 的聽閾平均值計算，根據標準對患者聽力損失程度進行分類，分為5級：正常≤25 dB；輕度聾=26～40 dB；中度聾=41～70 dB；重度聾=71～90 dB；極重度聾＞90 dB。PTA的聽力曲線類型分為斜坡型（slope）：聽力損失主要以2 000～8 000 Hz為主，患者聽力閾值水平隨測試頻率的升高而逐漸升高；平坦型（flat）：也稱全頻聽力下降型曲線，患者各聲音頻率的聽力水平基本一致；上升型（rising）：患者的低頻聽力250～1 000 Hz較差，隨測試頻率的升高聽力閾值逐漸降低；谷型（valley）：聽力損失以500～2 000 Hz為主；切跡型（notched）：僅單一頻率處閾值明顯升高，相鄰頻率正常或接近于正常；山型（ridge）：中間頻率閾值比兩端至少低20 dB。

1.2.2 DNA提取：抽取家系成員外周靜脈血2 mL于EDTA抗凝管中，采用DNA提取試劑盒（Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver 5.0，Takara）進行全基因組DNA提取，-20 ℃保存備用。嬰幼兒采集指尖或足底血，用濾紙吸取微量靜脈血后使用酚氯仿手工法提取全基因組DNA。

1.2.3 耳聾相關基因熱點突變分析：以提取的全基 因組DNA為模板，PCR擴增耳聾患者的GJB2、GJB3、GJB6基因編碼區以及線粒體12S rRNA、tRNASer(UCN)基因。相應的PCR擴增信息見表1。PCR產物經純化后送華大基因測序公司進行雙向測序，測序結果與標準序列進行比對，以確定是否含有耳聾相關熱點基因突變。

表1 GJB2、GJB3、GJB6基因編碼區以及線粒體12S rRNA、tRNASer(UCN)基因擴增信息

2 結果

2.1 GJB2基因突變分析 在這22例NSHI患者家系中，發現了79G＞A、109G＞A、176del16bp、235delC、 299delAT、341A＞G、368C＞A、608T＞C 8種突變。其中可能的病理性或致病突變包括176del16bp、235delC、299delAT[11-13]。在22例NSHI患者家系中有6個家系攜帶有這3種突變，235delC突變4例，復合雙雜合突變2例。在這6個家系中235delC突變檢出率最高，每個家系中均有患者檢出該突變。在這22個NSHI家系中，GJB2基因235delC突變攜總家系數的27.3%；其次是299delAT（占9.1%）；176del16bp僅在一個復合雙雜合家系中檢出（占4.5%）。而在患者中發現的其他GJB2基因變異：79G＞A、109G＞A、341A＞G、368C＞A、608T＞C均在對照組中有發現。對照組中還檢測出了21G＞A變異，同時也發現了2例攜帶有害突變235delC雜合突變。同時在樣本組與對照組中均未檢測出GJB3、GJB6基因的致病性突變（見圖1）。

圖1 GJB2基因突變檢測

2.2 線粒體12S rRNA和tRNASer(UCN)基因突變分析

在這22例NSHI患者家系中有3個家系還檢測出了線粒體12S rRNA基因1555A＞G突變（見圖2），并未在線粒體tRNASer(UCN)發現已知的致病性突變如：A7445G、A7445C、G7444A、7472insC、T7510C、T7511C等。線粒體12S rRNA基因1555A＞G突變作為已知的致病機制較為明確的可增強氨基糖甙類抗生素耳毒性的敏感性的位點，高度保守。當它發生A＞G突變時，會與1494位點形成1494C-G1555堿基配對。研究[7]表明：A1555G突變所形成新的G-C堿基配對可以使線粒體DNA與氨基糖甙類藥物結合更加容易。

圖2 線粒體12S rRNA基因1555A＞G突變檢測

2.3 先證者臨床資料分析 6個攜帶GJB2基因致病突變家系和3個攜帶線粒體12S rRNA 1555A＞G突變的家系圖見圖3，臨床資料見表2。NB150家系先證者I I I-2，男，16歲，先天性聾，雙側聽力下降，左耳聽閥91.2 dB，右耳聽閥88.7 dB；先證者父母均有聽力損失現象發生。NB152家系先證者I I I-1，女，13歲， 雙測聽力下降，先證者左耳聽閥91.2 dB，右耳聽閥 95.0 dB，其父母均表現為先天性聾啞；NB177家系先證者I I-4，女，56歲，幼年時期發病，有用藥史，聽力損失程度隨年齡逐漸加重，先證者左耳聽閥72.5 dB，右耳聽閥75.0 dB，另有2個姐妹及一外甥女耳聾；NB184家系先證者I I I-7，男，47歲，自幼耳聾，中度聽力損失，有一個兄弟及3個表弟表妹也發生聽力損失現象；NB187家系先證者I I-3，男，47歲，先證者左耳聽閥110.0 dB，右耳聽閥120.0 dB，先天性極重度聾啞，妻子、孩子均表現為極重度耳聾；NB189家系先證者I I-3，男，32歲，先證者左耳聽閥77.5 dB，右耳聽閥80.0 dB，哥哥、妻子聽力不好，但孩子聽力情況正常；NB192家系先證者I I I-1，男，20歲，先證者左耳聽閥66.6 dB，右耳聽閥89.2 dB， 表現為重度耳聾，父母聽力都有聽力損失現象發生；NB194家系先證者I I I-2，男，32歲，4歲時感冒注射藥物（具體藥物不詳）導致耳聾，左耳聽閥79.2 dB， 右耳聽閥76.7 dB，媽媽和一個阿姨有輕度聽力損失現象；NB195家系先證者I I-2，男，62歲，左耳聽閥50.0 dB，右耳聽閥60.0 dB，雙胞胎兄弟及一個妹妹均為先天性聾啞。

表2 9例攜帶致病突變先證者及患病家屬臨床資料分析

2.4 耳聾相關突變熱點分析 GJB2基因突變可導致DFNB1和DFNA3，是NSHI最常見的原因。在NSHI患者中已經發現了100多種GJB2基因突變類型，突變范圍幾乎涉及該基因所有編碼區域，突變形式包括剪切、無義突變、錯義突變、插入及缺失導致移碼突變等，這些突變在不同種族人群中的發生頻率和分布情況差異很大。GJB2基因病理性突變包括有：30delG、35delG、35insG、167delT、176-191del16、235delC、299-300delAT、504insGCAA等。其中歐美人群中以30delG/35delG最為常見[14]，猶太人的突變熱點是167delT[15]，蒙古人種是235delC[16]，日本人突變熱點是233delC[17]。GJB2基因編碼的Cx26蛋白，屬于縫隙連接蛋白家族，在耳蝸毛細胞中高豐度表達，與相鄰細胞的縫隙連接蛋白組成一個完整的縫隙連接通道，這些通道在信息傳導和物質交換中起重要作用[18]。GJB2基因突變可在蛋白質的翻譯、運輸或半通道的裝配水平上影響縫隙連接通道的形成或功能障礙，導致包括鉀離子在內其他代謝產物的交換異常[19]。GJB2的缺乏可造成先天性聽力損失，而缺失、框移、剪接和不穩定轉錄等涉及功能缺失的突變可能與綜合征或成年后耳聾有關，并且決定于突變位點的重要性及替換氨基酸的性質[20-21]。

圖3 9個NSHI患者家系圖

本研究通過對浙江余姚地區22個NSHI患者家系進行常見耳聾致病基因篩查檢測到GJB2基因上常見突變5種79G＞A、109G＞A、341A＞G、368C＞A、608T＞C 8，致病突變3種176del16bp、235delC，299delAT。235delC會導致移碼突變，產生無功能蛋白；176del16bp后，175位點后16個堿基丟失導致59號密碼子移碼，最終終止密碼子提前至75號，也會產生無功能蛋白；299delAT導致Cx26多肽的CL區大部分缺失，TM3、EC2和TM4區完全缺失，使蛋白功能受損。本研究收集的GJB2基因突變患者家系中都檢測出了235delC突變，且均表現為先天性聽力損失，但聽力損失程度及類型有差異。在2個GJB2基因復合雜合突變家系中，患者也都表現為先天性聽力損失。

在這22個NSHI患者家系中有3個家系發現了線粒體12S rRNA 1555A＞G突變。12S rRNA是氨基糖甙類藥物性聾和NSHI有關的一個線粒體DNA突變熱點。1555位點位于12S rRNA的高度保守序列。當出現突變時，12S rRNA的結構發生改變，與細菌蛋白核糖體的結構更相似，因此與氨基糖營類抗生素的親和力更高。氨基糖普類抗生素與線粒體12S rRNA作用會抑制氧化磷酸化過程中的呼吸鏈蛋白合成，引起耳毒性。而在沒有氨基糖營類抗生素的條件下，線粒體A1555G突變本身也可以造成蛋白質合成過程中的翻譯異常而出現耳蝸中細胞內ATP的合成降低，離子泵失能而導致離子代謝的穩態被打破，從而出現了耳聾[22]。

3 討論

對6個攜帶有GJB2基因致病性突變家系分析發現，其中有235delC雜合、235delC純合、235delC與299delAT復合雜合突變、176del16bp與235delC復合雜合突變、176del16bp與299delAT復合雜合突變幾種情況。綜合臨床資料，可以發現他們的臨床表型具有一定差異。在NB187家系內的5名患病成員都是GJB2復合雜合突變，表現為極重度聾，但同樣是攜帶有GJB2復合雜合突變的NB195家系成員的聽力損失程度僅為中度。在NB150家系中，先證者父親攜帶有235delC雜合突變，臨床表現為中度耳聾，嚴重程度低于攜帶有235delC純合突變的先證者，同時我們在對照組中也發現了235delC雜合突變，攜帶者聽力損失并未受損。對單純攜帶235delC純合突變的患者分析，我們能夠發現在他們的臨床表型，包括聽力損失程度、聽力曲線類型等也有較大差異。提示在這些患者中可能存在其他基因或環境因素與GJB2基因協同作用影響了患者的臨床表型。

對3個攜帶有線粒體12S rRNA 1555A＞G突變家 系分析發現，他們并未攜帶有其他致病性線粒體基因突變，NB177家系母系成員耳聾外顯率為44.4%，先 證者使用過氨基糖甙類藥物，幼年發病，聽力損失程度隨年齡逐漸加重，表現為重度耳聾，另有兩姐妹 和一個外甥女發病，用藥情況未知；NB184母系成員系耳聾外顯率為50%，患病家系成員聽力損失程度 以輕、中度為主，患者陳述未用過氨基糖甙類藥物；NB194家系中先證者出生時聽力正常，4歲時發燒注射鏈霉素后發生聽力損失現象，其母親與姨媽均有輕度聽力損失，用藥情況不明，患者子女無聽力損失現象，對該家系成員的信息采集不夠完全，無法統計耳聾外顯率。這些患者家系中母系成員的外顯率較高，但有一定差異，父系成員很少有聽力損失現象發生，符合母系遺傳特征。患者用藥情況、聽力損失程度、發病年齡均有一定差異提示其他因素如AmAn、核修飾因子以及本研究發現的保守性指數較高的其他氨基酸變異也可能影響線粒體12S rRNA 1555A＞G突變致聾的表型表達。

本研究從臨床特點、家系關系、遺傳學特征對 寧波市余姚地區的22個NSHI患者家系進行了綜合分 析。在對他們進行耳聾相關熱點篩查發現，有6個家 系攜帶有GJB2基因致病性突變，占27.3%；3個家系攜帶有線粒體12S rRNA 1555A＞G突變，占13.6%。這可能是導致寧波市余姚地區遺傳性NSHI的主要原因。可能是由于樣本量不夠多的原因，并未在這些家系中發現有GJB3、GJB6基因致病性突變。

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（本文編輯：吳彬）

The genetic analysis of patients with non-syndrome deafness come from twenty-two families in Yuyao, Zhe-jiang province

PENG Guanghua1,2, WANG Hui2, YAO Juan2, FAN Wenlu2, TANG Xiaowen2, ZHENG Binjiao2,

XUE Ling2, LYU Jianxin2, GUAN Minxin2,3. 1.Department of Otolaryngology, Yuyao People’s Hospital, Ningbo, 315400； 2.Attardi Institute of Mitochondrial Biomedicine, Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325035；3.Institute of Genetics, Zhejiang University, Hangzhou, 310058

Objective: To explore the clinical, genetic and molecular characteristics of twenty-two families with non-syndrome deafness in Yuyao area. This study focused on analyzing mutations of mitochondrial gene and coding sequence of GJB2, GJB3, GJB6 gene. Methods: The samples were 33 patients with non-syndrome deafness come from 22 families in YuYao People’s hospital, and 254 cases with normal hearing. DNA were extracted out from peripheral blood of all subjects. All samples’ GJB2, GJB3 and GJB6 gene encoding region and mitochondrial gene were analyzed by direct sequencing, audiological examination, genetic testing for deafness and pedigree data. Results: The sequencing results revealed that 4 families carried GJB2 235delC mutation, 2 families carried GJB2 compound heterozygous mutations accounted for 27.3% and 3 families carried mitochondrial 12S rRNA A1555G accounted for 13.6% in the 22 families with non-syndrome deafness. All families without pathogenic mutations in the GJB3 and GJB6 encoding region. According to clinical data, 6 families with GJB2 gene mutations and 3 families with 1555A＞G mutations had different levels in hearing loss, age of onset, and the rate of hearing loss. Conclusion: GJB2 and mitochondrial 12S rRNA 1555A＞G gene mutation are the main genetic inheritance for the patients with non-syndrome deafness in Yuyao area, there may also be other unknown genes or environmental factors to coordinated with GJB2 gene and mitochondrial 12S rRNA gene co-modulate the variable penetrance and expressivity of deafness.

non-syndromic deafness； GJB2； mitochondria DNA； gene mutations

R764.04

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2016.10.002

2015-11-18

國家青年科學基金資助項目（31401070，31100903）；浙江省自然科學基金資助項目（Y2110399）；寧波市自然科學基金資助項目（201301059）；溫州醫學院科研發展基金資助項目（QTJ13017）。

彭光華（1975-），男，浙江寧波人，主任醫師。

管敏鑫，教授，博士生導師，Email：gminxin88@gmail.com。