生物電催化系統在健康領域的應用及發展趨勢

合肥工業大學 信息工程系，安徽宣城 242000

一、前言

生物電催化系統基于生物實體，其催化涉及化學變化和電能之間相互作用的電化學過程。生物催化裝置或與酶、完整細胞、部分細胞或與組織相關，可用于不同用途，如發電、生物修復、化學合成和生物傳感，尤其是在生物傳感中的應用，更是取得了商業（年營業額可高達130億美元）和學術雙豐收。

生物傳感器是一門集微電子學、材料科學、物理化學和生物技術等諸多學科于一身的交叉學科。目前傳感器類型以電化學傳感器為主，在臨床診斷、食品分析、環境監測等領域應用前景廣闊。雖然與國際研究有一定差距，但國內在該領域的研究也發展迅猛，近十年平均每年約有600篇相關論文在國內期刊發表，應用范圍包括食品農藥殘留、獸藥殘留、重金屬污染、生物毒素（尤其是黃曲霉素）、環境監測和人體健康等[1-4]。

隨著社會的進步和發展形勢，人們越來越關注自身的健康，相關費用也占很高比例。根據世界衛生組織（WHO）統計，美國衛生保健支出占其GDP 18%以上，在歐洲占9.5%。所以目前國內、外主要集中在生物傳感用于健康監測方面的研究，因為它有助于大大降低醫療成本，提高人們的生活質量。

本綜述聚焦于生物電催化系統在健康監測中的生物傳感應用，主要討論過去十年用于健康監測的生物催化系統發展趨勢和主要成就。

二、生物傳感器中的生物催化劑

在生物傳感器中，生物催化是指生物識別元件，通過化學相互作用并轉化為可檢測的電信號來識別目標分析物。雖然各種識別元件已用于構建生物傳感器，但酶是最早的而且還是目前最常用于生物傳感的識別元件[5]。電化學生物傳感主要使用的是一種特定酶類，如氧化還原酶和氧化酶。由于酶的生物識別簡單、成本相對較低，使得酶促生物電催化系統在復雜基質（如生物體液和環境樣品）分析中幾乎是不可或缺的，因此它們在健康應用中極其重要，如果考慮到糖尿病的多發和葡萄糖氧化酶出色的催化特性，血液葡萄糖生物傳感器約占世界市場份額的85%就不足為奇了[6]。然而酶也有一些缺點，如生產和提純工藝復雜、壽命短以及由于酶的高度專一性導致其很難用于多組分分析物的分析。

微生物細胞是可用于生物傳感的另一類生物催化劑，其催化作用是由細胞內的酶來實現的。1911年首次報道了全細胞生物電催化作用[7]，但一直到1975年才將其應用于生物傳感器，這種生物傳感器基于應用帶有氧電極的木醋桿菌。因為信號生成類似于酶促生物催化反應，微生物生物傳感器的發展代表了酶電極概念的擴展。

本質上，應用微生物細胞、部分細胞或組織的生物催化系統可以考慮為“酶包”[8]。全細胞的使用可以克服酶促生物電催化的一些不足之處，使用全細胞不要求酶的純化，可使生物催化系統更加穩定，而且允許使用單個生物催化元件進行多個分析物的檢測。然而與酶相比也有不足，如需要提供細胞營養和能量，信號生成速度慢以及缺乏特異性。當然最后一點是微生物生物催化劑的優點，也是它的不足，這主要取決于其用途。例如當需要檢測海洋毒素或重金屬時[9,10]，使用全細胞就有其優越性；但當進行復雜基質中的葡萄糖或乳酸檢測時[11,12]，毫無疑問使用酶更加有效。

生物電催化系統依賴生物催化劑和電極之間的電化學接觸。酶促生物電催化有可能間接通過電活性媒介，或者通過生物催化劑活性部位和電極之間的直接電子轉移（Direct electron transfer，DET），或者通過介導電子轉移（Mediated electron transfer，MET）即人為將小分子引入系統，在酶和電極之間穿梭電子。全細胞利用相似機制完成電子轉移，DET是通過細胞外膜的細胞色素或通過特定的生物納米結構來完成的[13,14]，而MET則是利用生物合成的氧化還原介質（如黃素類、吩嗪和醌類）或化學的外緣介質[15,16]。因為傳感器的生物和物理部分之間的電化學接觸會直接影響其分析性能，所以在設計用于生物傳感的新型生物催化系統時，要特別加以關注。

三、生物傳感器的發展趨勢

目前人們大多是在醫院進行健康監測的，下一步是希望把生物傳感器用于家里、口袋里或手腕上來進行相關監測，其核心是在基因、蛋白和代謝水平上，快速、方便和容易測量人們身體的化學物質、身體與周圍環境的互相作用以及人們的食物，這就要求下一代相關產品盡量小型化及完全集成平臺，如全印刷生物傳感器、集成采樣和穿戴式裝置等。

1、小型化

小型化是生物傳感器技術中一個最顯著的趨勢，具有許多優點，如低成本批量生產、易于存儲和銷售、改善分析性能、可能制造多分析物的生物傳感器等。目前基于電化學轉換機制、陣列和芯片技術的進步，使相關生物傳感器大大小型化。

（1）基于電化學轉換機制的生物傳感器

在所有小型化生物傳感器系統中，基于電化學轉換機制的產品是最成功的，考慮到成本效益、構建和操作的便攜性和簡單性，使其成為最有希望的發展方向。電化學生物傳感裝置包含一個電化學單元，通常由兩電極或三電極系統構成，其中至少一個電極作為生物識別元件，一個作為電化學檢測器。電極很容易小型到微米或納米級別。電化學檢測器和控制儀表也能通過使用微加工和微細加工技術有效降低尺寸[17-19]。

（2）基于微電極陣列的生物傳感器

微電極陣列（Microelectrode array，MEA）包括單獨尋址電極或連接電極，連接電極的制造技術簡單，但單獨尋址電極用于生物傳感器工藝更加具有優勢，如高空間分辨率和可能用于多分析物的檢測。

首個基于MEA的生物傳感器于1994年問世，葡萄糖氧化酶（glucose oxidase，GOx）等通過光刻固化于沉積在鉑陣列上的聚吡咯薄膜，在優化條件下監測所有三個傳感器的電流響應。現有類似的固化酪氨酸酶的MEA生物傳感器可同時用于監測環境中的多巴胺和兒茶酚，提高了敏感性和特異性。將心肌細胞培養在自組裝單層修飾的納米鉑電鍍MEA上，制備的便攜式8通道無線MEA系統對自然環境監測，以及在海洋毒素、石房蛤毒素、短裸甲藻毒素等濃度增加的情況下，對心肌細胞電活動進行無創監測，根據波尖幅度、發射率和50%尖峰電位持續時間等信號參數變化，進行定量評價和毒理學風險評估[20]。

（3）基于微帶電極陣列的生物傳感器

微帶電極陣列通常用于制作叉指陣列(Interdigital array，IDA)式生物傳感器。IDA 包含兩對工作電極，表示平行導電材料和交叉隔離的絕緣材料。其工作原理是在兩個電極上施加不同電壓，循環的氧化-還原產物的電催化反應會導致電流信號放大。同MEA相比，IDA主要優勢在于其較低的檢出限。

Pavinatto等報道了一個金制IDA，直接在塑料基底上噴墨印刷制作柔性和全打印阻抗生物傳感器，采用面積大、產出高的凹版印刷法將含有酪氨酸酶的活性層沉積在印刷結構上，用于葡萄酒和橄欖油中的多酚類物質檢測。特別注意的是優化印刷條件以實現沉積小于100μm電極以及開發含酶油墨凹版印刷技術[21]。

絲網印刷作為生產低成本電化學裝置的一個標準技術也適用于制造小型化的生物傳感器，因為絲網印刷最小的尺寸大約為50～100μm，不足以制造微電極，因此，在創建微帶結構時使用了交叉切割技術。Hart研究小組制造了微帶葡萄糖生物傳感器，采用絲網印刷含有氧化還原介質和GOx的水基碳油墨，然后加絕緣層，將這種結構垂直切割露出20μm厚、3mm長工作電極的邊緣。該傳感器適用于連續加工-監測，在葡萄糖消耗等情況下，通過切割有可能使自動生物傳感器恢復[22]。

（4）芯片實驗室

將生物電催化系統與微流體相結合用于研發小型化的集成在一個芯片上的實驗室裝置，是生物傳感器技術一個新出現的領域。

Itoh等證明了一種便攜式的、基于液滴的微流體裝置可用于魚新鮮度的現場電化學測定， 標記物為5'-三磷酸腺苷（Adenosine Triphosphate, ATP），固定在微電極Na fi on層的雙酶系統用于測量ATP濃度。在識別過程中，甘油首先由甘油激酶磷酸化形成甘油-3-磷酸，然后甘油-3-磷酸由磷酸氧化酶氧化，產生過氧化氫，從電流測定上來定量。該裝置的檢測結果與傳統高效液相色譜法的有良好的相關性[23]（見圖1）。

Matharu等研發了一種含有包埋辣根過氧化物酶的水凝膠微結構的生物傳感器，用于檢測乙醇和抗氧化劑對肝細胞的影響，通過產生炎癥信號（如細胞因子和活性氧等），在對乙醇毒性觸發響應中起關鍵作用。將 MEA 集成到一個微流體裝置上并以膠原蛋白修飾，可以促進肝細胞的粘附性，肝細胞暴露于乙醇和過氧化氫氣氛中，然后通過循環伏安法監測4h以上。加入乙醇之前將抗氧化劑和肝細胞一同培養，導致過氧化氫水平下降5倍，說明該生物傳感器可用于監測氧化應激，因此可用于研究抗氧化劑的效果[24]。

未來由于微技術發展，有望進一步降低小型化電化學生物傳感器的成本和大小，可以使用諸如聚合物和納米材料等新材料來制造微結構。

不同領域研究成果的匯聚可能給生物傳感器技術更多的新方向。例如“智能塵埃”概念的延伸[25,26]，涉及到毫米級別分布式電子元件網絡，可以感知環境并在環境和使用者之間進行通訊。

另外一個快速發展趨勢是智能手機技術和緊湊型電化學生物傳感器的結合[27]，所形成的產品有望促進遠程診斷和檢測的更多應用，特別是在缺乏足夠醫療資源和實驗室設備的發展中國家。例如AgaMatrix首次將商用電流型葡萄糖傳感器與手機實現了交互，并于2011年12月7日獲得了美國食品和藥物管理局510(k)許可，隨后由制藥巨頭賽諾菲(Sano fi Aventis)公司在2012年以 iBGStar app的方式上市。然而直到今天，大多數研究還只是將手機當作基于光傳導機制的圖像設備來應用，未來希望在用于電化學生物傳感器的智能手機平臺與RFID和近場傳輸系統的創新性適應性上取得進展。

盡管小型化生物電催化系統發展迅速，但具有高空間分辨率的微米和納米結構上的生物識別元件的固定仍然是一個難題，對于多分析物裝置來說尤其需要在傳感器電極和生物元件之間提供有效的電子轉移。另外一個難題是由電極大幅度減小到納米級別所帶來的，如批量運輸有限、基線漂移相關的噪聲問題以及在制造過程中需要更加先進和昂貴設備。通常人們更關注小型化產品所具有的明顯優勢，而對上述問題有所忽略。使用微米傳感器而不是納米傳感器是一個比較好的折中辦法。為了進一步改善微米傳感器的分析性能并減小分析探針體積，開發具有連續流的微米生物傳感器，而不是減小電極尺寸，將是一個好的解決辦法，因此未來將會有更多微流體與電化學生物傳感器結合的機會。

2、 紙質設備

由于份量輕、價格便宜、環境友好、易印刷包裝、生物兼容及可一次性使用等特點，紙作為即時檢驗（point-of-care, POC）設備的誘人材料又出現在人們面前。基于紙質的分析設備有潛力將生物傳感器技術引入發展中國家的醫療診斷中，因為它們更符合世界衛生組織有關發展中國家醫療診斷的“放心”理念：可負擔、敏感、特異、使用方便、快速和自動、不需其他設備、可交付終端用戶等。

紙質形式的比色檢測和橫向分析是一種很成熟的技術，如用于尿液葡萄糖檢驗和女性孕檢。盡管這種裸眼可視化檢測操作簡便、價格低廉，但對高靈敏度日益增長的需求，特別是健康應用中數據的傳輸等，對此檢測方法提出了挑戰，這促進了紙質設備檢測技術與儀器檢測技術的結合，如手機比色檢測、熒光、化學發光和電化學[28]。除了上述小型化電化學檢測的優點外，紙質裝置還有對周圍光、照明和串色不敏感以及與紙印刷技術高度兼容等優點[29]。

自1995年Medisense (Abbott)公司生產第一只商用電化學葡萄糖傳感器以來，電化學紙質分析裝置(Electrochemical paper-based analytical device，EPAD)中的生物電催化系統已用于多種健康應用。將紙基平臺與電化學檢測結合主要有兩種策略：一種是使用印刷技術直接在紙質上制作電極或通過濺射沉積金屬制作電極[30-32]；另一種是將含有固化生物識別系統的紙片安放在常規電極上（通常是絲網印刷電極[33]）。EPAD中微流體通道的制作常使用光刻、蠟印、浸蠟和蠟染等工藝，進而形成電化學微流體紙質分析裝置（Electrochemical microfluidic paper-based analytical device, EμPAD）。

Noiphung等介紹了一種結合血漿的紙片，放在絲網印刷碳電極上，用來檢測全血樣品中的葡萄糖，這種紙片呈啞鈴形，分成兩個區域——血漿分離區和浸蠟法形成GOx修飾的檢測區[34]。

Henry研究小組首次嘗試將微電極引入EμPAD，通過填孔制作微電極，采用激光雕刻技術，用碳糊制成聚酯薄片。為了保證電接觸，使肜“三明治”型雙電極配置中將工作電極與銀絲網印刷紙相結合[35]。

Whitesides研究小組證明了整合EμPAD與商用血糖儀的可能性。在色譜紙上制備EμPAD，由蠟染形成微流體通道，使用安培法測定用于分析人體血漿中的葡萄糖、膽固醇和乳酸以及水溶液中的乙醇。分析所需化學試劑或儲存在EμPAD檢測區，或與分析物混合儲存在單獨試管中。這種集成型裝置比商用測試條的精確度低，但進一步改進后可用于較便宜的POC設備[36]（見圖2）。

Beni等首次證實了全集成混合印刷電子（Hybrid printing electronics, Hy-PE）紙質裝置用于電流測量的可行性，該方法將技術較為成熟與先進的電化學生物傳感器與以簡單制造技術生產的一次性設備集成起來，在常溫即可完成此類系統的制作。儀器中集成了絲網印刷的二氧化錳電池與垂直電致變色顯示器。顯示器類似紙，以反射模式工作，沒有背光照亮像素。這種集成生物傳感平臺可用于不同診斷系統，如電流式酶電極、電化學親和性分析和一般電解分析[37]。

紙質分析裝置在POC診斷和資源有限的條件下可提供性價比較高的解決方案。然而紙基裝置缺乏堅固性通常導致其在實際的應用中性能不足。這主要有兩個不穩定的原因，第一個是需要更為有效的方法固定生物識別元件以便在生物傳感元件和電極之間保持快速電子轉移；第二個是溫度和濕度對微流體通道中液體流動力的影響而導致信號變化的問題。此外低靈敏度是紙質裝置的另一個缺點，最近有研究人員嘗試在EμPAD中結合納米材料和微電極來增加敏感性，中空通道EμPAD的進一步開發有望擴大可分析物的范圍[38,39]。

在POC診斷和監測中對于價格低廉的集成平臺的需求，將進一步促使價格便宜操作簡單的便攜式電化學閱讀器、紙質裝置、能量存儲裝置、晶體管和其他有源元件等的開發取得突破。自供電生物傳感器或太陽能電池與EμPAD結合將會降低成本，提高集成式紙質裝置的敏感性[28,29]，生物分析與現代電通信結合是未來POC裝置的一個新主題。

3、穿戴式生物傳感器

過去十年有關穿戴式生物傳感器的開發已吸引了許多關注，其逐漸普及也反應了健康監測的主要趨勢，即從基于醫院的專業護理系統轉向基于家庭的個人醫學。在用于心率、血壓、體表溫度、身體運動等人體參數的監測上，穿戴式物理傳感器的開發已取得了很大進步[40]。然而用于監測化學信息的穿戴式無創生物傳感器仍處于早期開發階段，造成這種情況的原因有多種，比如難以獲得合適的樣本、低濃度分析物的檢測存在困難、樣品量少、生物傳感器存在污損及兼容性問題等等[41]。

穿戴式電化學生物催化傳感器的體外監測，可用于眼淚、唾液、汗液和皮膚組織液中的分析物監測[41]。Parviz與合作者首次將GOx固定在隱形眼鏡上用于葡萄糖監測，通過在聚合物基底上構建微結構來制作葡萄糖生物傳感器，然后再塑型為隱形眼鏡[42]。也有研究團隊將生物催化識別元件整合進類似于紋身的電化學裝置中，實時檢測人在自行車運動期間汗液中的乳酸濃度[43]（見圖3）。

實現完全穿戴式生物傳感器的主要障礙是為傳感器和電子電路元件尋找合適的電源。基于酶和微生物的生物燃料電池（Biofuel cell，BFC）可利用穿戴者自身的能源，有望成為穿戴式生物傳感器的電源供給。

Sekretaryova等介紹了基于單一酶的自供電生物傳感器的概念。例如，在檢測全血漿中游離膽固醇時，陽極和陰極都設在碳布電極上溶膠-凝膠中固化的膽固醇氧化酶，介導的生物催化膽固醇氧化為陽極反應，產生的過氧化氫的電催化還原作為陰極反應[44]。

J?nsson-Niedziolka等制作了集成式自供電生物傳感器，BFC包括碳納米材料修飾的氧化銦錫陽極，以及垂直排列的碳納米管或碳納米顆粒用于基于抗壞血酸氧化和膽紅素氧化酶的呼吸式陰極[45]。

電化學傳感器為穿戴式生物傳感器用于身體和環境監測提供了許多優勢，因為它們能很容易小型化，執行小體積樣品的高靈敏度分析，并可與紡織材料甚至直接與皮膚整合。

盡管在穿戴式生物傳感器開發上取得了顯著進展，但在制造功能化、實時、集成監測裝置上仍有很多難題需要攻克。比如如何在穿戴期間保留生物識別系統的生物催化活性，如何將柔性生物電子與生物傳感器元件相結合。還有一個以前很少提及而現在越來越引起注意的研究方向——將電化學傳感器、電子器件、電源和無線傳輸系統集成進小型化裝置。最后一個是尋找無創分析中體液樣本不同分析物濃度與病人健康狀況之間的聯系。

進一步開發完全自動化、易穿戴的穿戴式傳感器，要求印刷和柔性電子技術的提高，如人體傳感器網絡中的化學傳感器與電子皮膚的集成。直接從穿戴者身體的生物體液中獲得電能似乎是研究完全集成式穿戴生物傳感器的一個可行的方法，如基于BFC的自供電傳感器和邏輯門自供電生物傳感器等。另外無創性電化學生物傳感器也是個人健康監測系統中非常重要的。進而針對移動醫療，將具有直接傳輸數據到手機、平板電腦或局域網的無線系統與傳感設備集成，是生物傳感技術中新興的領域。

四、結束語

用于其它重要分析物的新型無創電化學傳感器也是個人健康監測系統中極為需要的研究方向，包括物理傳感器和生物傳感器，具有無線數據傳輸系統的傳感器裝置直接與手機、平板或局域網的集成，是靶向移動醫療健康生物傳感器技術的一個新領域，未來通過大數據與專家系統集中提供輔助決策將顯著降低醫療費用。

盡管在健康應用領域不斷有新型生物電催化系統的研究報道，然而 基于酶的血糖生物傳感器仍然在學術文獻中大量出現，其銷售額依舊統治生物傳感器的世界市場，這主要是由于受到1型糖尿病患者大量使用一次性產品的嚴重影響，這將掩蓋許多其它符合臨床和其他需求的商用生物電催化系統的成功。

在一種新型生物電催化系統能夠應用到日常生活中之前，需要對許多問題進行評估。傳感器工藝中的穩定性、重復性和敏感性也仍需進一步優化。進步研究了解直接和間接路徑的電子轉移機制、在生物催化系統中開發新型和更加有效的方法來調節生物催化系統中的電子轉移是未來傳感器裝置成功商用的必由之路。