食品中黃曲霉毒素的檢測與控制

郭倩（東勝區食品藥品監督管理局，內蒙古東勝　017000）

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食品中黃曲霉毒素的檢測與控制

郭倩
（東勝區食品藥品監督管理局，內蒙古東勝017000）

【摘 要】黃曲霉毒素（AFT）是由某些真菌產毒菌株產生的次生代謝產物，具有極強的毒性、致癌性，在自然界中普遍存在。隨著技術的發展和各國的重視，其檢測方法也不斷發展。本文就高效液相色譜法、薄層色譜法、免疫分析法等幾種AFT檢測技術作論述，簡述了AFT的控制措施及對其檢測方法的發展作了展望。

【關鍵詞】黃曲霉毒素檢測控制

黃曲霉毒素（Aflatoxin，AFT）是由黃曲霉（Aspergillus flavus，Aspergillus nomius）和寄生曲霉（Aspergillus parasiticus）等多種真菌產生的次級代謝產物，是一類化學結構相似且毒性極強的物質，目前已分離鑒定的約有20種，其中以B1、B2、G1、G2和M1、M2為主。在天然污染的食品中以B1最為多見，其毒性和致癌性也最強［1］。黃曲霉毒素對人類和家畜的健康危害很大［2］。據世界糧農組織（FAO）報告，全球每年約有2%的農作物因受其污染而失去營養和經濟價值［3］。近年來，進出口商品中均有黃曲霉毒素超標現象，因此黃曲霉毒素已經成為出入境食品安全檢測的重要項目。

1　黃曲霉毒素的檢測方法

1.1高效液相色譜法（HPLC）

HPLC因其高效、快速、靈敏度高、重現性好、準確可靠等優點，成為黃曲霉毒素定量測定應用最廣的方法。MycoSep系列多功能凈化柱（MFC）是專用于霉菌毒素分離純化的固相萃取柱，其最大優點是可一步完成凈化過程，且凈化效果理想［4］。

反相HPLC（RP-PLC）采用填充硅膠顆粒的流動池的熒光檢測，靈敏度可以達到1ng水平以下。為了加強熒光，一般通過強氧化劑（TFA等）或鹵族元素及衍生物在柱前或者柱后進行衍生處理［5］。

林裕［6］用高效液相色譜法檢測黃曲霉毒素Bl、B2、Gl、G2，認為該方法操作安全、快速、準確度高、精密度好。

免疫親和層析凈化高效液相色譜法是HPLC的一種，被我國定為國標方法［7］。該方法基本操作是先將試樣中的黃曲霉毒素用一定比例的甲醇/水提取，提取液經過濾、稀釋后，用免疫親和柱凈化，以甲醇將親和柱上的黃曲霉毒素淋洗下來，將甲醇-黃曲霉毒素淋洗液的一部分注入HPLC中，對黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2分別進行定量分析［8］。

然而一直困擾人們的問題是熒光檢測器對四種AFT分子具有選擇性，即對B2、G2的靈敏度高，而對B1、G1的靈敏度很低。因此，通常用兩種方法來提高B1和G1的熒光性：一是通過改變流動相或改進檢測器來降低物質熒光性的損失，二是對熒光性弱的物質進行柱前或柱后衍生以增強其熒光性。

1.2薄層色譜法（TLC）

薄層色譜法（TLC）的原理是利用樣品中的黃曲霉毒素與其他物質在固定相硅膠和流動相中的分配系數不同，達到分離的目的，再用365 nm波長的紫外線激發黃曲霉毒素產生熒光，根據熒光的強弱與標準品比較測定其含量。1990年該方法被列為AOAC標準方法。本法既可用于定性分析，也可用于定量測定；既可目測，也可用紫外分光光度計、熒光光度計定量［9］。TLC法是檢測AFB1的經典方法，仍為普通實驗室的常用方法［10］。

目前，在TLC法基礎上又發展了高壓薄層色譜法（overpressured Thin Layer Chromatograp，OPTLC）［11］。OPTLC是Tyihak在1979年提出的，它結合了經典薄層色譜法、高效薄層色譜法與高效液相色譜法的優點而發展起來的一種能提高薄層分離效率的平面液相色譜技術。

1.3免疫學方法

1.3.1酶聯免疫吸附法

酶聯免疫吸附測定法是免疫酶技術的一種，1966年建立了ELISA法，1971年又提出了用可溶性抗原或抗體與固相載體結合，而保留免疫成分的反應性的酶聯免疫吸附試驗（ELISA）［5］。其原理是：樣品中的黃曲霉毒素B1與定量特異性抗體反應，多余的游離抗體與酶標板內的包被抗原結合，加入酶標記物和底物后顯色，與標準比較來測定含量。該方法靈敏度高，特異性強， 檢測結果穩定準確，實驗操作污染少，一次實驗可檢測多個樣品。我國應用酶聯免疫方法測定食品中黃曲霉毒素的方法原理是：試樣中的AFB1經提取、脫脂、濃縮后與定量特異性抗體反應，多余的游離抗體則與酶標板內的包被抗原結合，加入酶標記物和底物后顯色，與標準比較測定含量［11］。

目前，研究人員將酶聯免疫吸附法（ELISA）和高效液相色譜法（HPLC）兩種方法結合使用。這種方法的優點是既可以快速篩檢大量陰性樣品，同時又能準確檢測陽性樣品中每種AFT的含量。2005年，柳潔等［12］將樣品首先用直接競爭ELISA方法初篩測定，陽性樣品再用免疫親和柱凈化、熒光檢測器測定的HPLC方法驗證和準確定量AFT。將兩種方法結合使用，可利用檢測方法各自的優點，既可以快速篩檢大量陰性樣品，節省時間，同時又能準確檢測陽性樣品中每種AFT的含量，在經濟上也更節省。

1.3.2免疫親和柱-熒光光度計法

該法以單克隆免疫親和柱為分離手段，用熒光計、紫外燈作為檢測工具的快速分析方法，克服了TLC和HPLC法在操作過程中使用劇毒的真菌毒素作為標定標準物和在樣品預處理過程中使用多種有毒、有異味的有機溶劑對操作人員造成身體傷害和污染環境的缺點。同時黃曲霉毒素免疫親和柱-熒光光度計法分析速度快，一個樣品只需要10-15min，比傳統方法快幾個小時甚至幾天時間，儀器設備輕便、容易攜帶，自動化程度高、操作簡單，能直接讀出測試結果［11］。

1.4其他檢測方法

1.4.1AFT快速檢測卡

拜發公司提供AFB1和AFT Total速測卡。前者基于免疫膠體金技術，即氯金酸在還原劑作用下，可聚合成一定大小的金顆粒，形成帶負電的疏水膠體溶液，由于靜電作用而呈穩定的膠態，故稱膠體金。膠體金標記實質上是蛋白質等高分子被吸附劑膠體金顆粒表面的包被過程。球形顆粒對蛋白有很強吸附性，可與各種蛋白、多肽成綴合物，利用金顆粒高電子密度的特性，在金標蛋白結合處，顯微鏡下可見黑褐色，當這些標記物在相應配體出處大量聚集時，肉眼可見紅色或粉紅色斑點，因而可用于AFB1和B2定性或半定量檢測。后者基于通常的酶聯免疫方法，將單克隆抗體連接在卡的膜上，檢測黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2的總量，檢測限可調為4-30 ng.g-1［13］。

1.4.2激光誘導熒光（LIF）-高效毛細管電泳（HPCE）

馬良等［14］采用自行設計搭建的激光誘導熒光（laser induced fluorescence，LIF）-高效毛細管電泳（（high per-formance capillary electrophoresis，HPCE）檢測平臺，建立LIF-HPCE法對食品中的黃曲霉毒素B1進行高靈敏度檢測。本研究擬首次采用自行搭建的LIF-HPCE檢測平臺，對AFB1進行激光誘導熒光檢測，采用膠束電動高效毛細管電泳模式檢測分離AFB1，建立高靈敏度AFB1的LIF-HPLC檢測技術，為糧油等農產品、食品中AFB1的高靈敏度檢測提供技術手段。

1.4.3微柱篩選法

微柱篩選法是將樣品提取液通過由氧化鋁與硅鎂吸附劑組成的微柱層析管，雜質被氧化鋁吸附，AFT被硅鎂吸附劑吸附，在365 nm紫外線下呈藍紫色熒光，其熒光強度在一定范圍內與AFT的含量成正比，由于微柱不能分離AFB1、B2、G1、G2，故檢測結果為AFT的總量［13］。

1.4.4水平衰減全反射比傅立葉變換紅外光譜法

采用水平衰減全反射比技術獲得傅立葉變換紅外光譜，可用來檢測AFT的含量，這是一種較新的檢測分析方法［5］。Mirghani等采用此方法測定了花生及花生餅中AFT（AFB1、AFB2、AFG1、AFG2）的含量。檢測時用AFT標準品校準，無需對基質進行預分析。

2　黃曲霉毒素的控制

目前，對于黃曲霉毒素的控制方法方面的報道還不是很多，但是可以通過改變食物的貯存條件來達到控制黃曲霉毒素產生的目的。黃曲霉毒素普遍存在于酶變的大米、花生食品中。有實驗證明，在溫度28℃-30℃，相對濕度80%以上的條件下最適合黃曲霉的生長［6］。因此，在制定黃曲霉毒素的控制措施方面應從食物的儲存條件及方法方面入手。首先，糧食及食品的儲存應保持在低溫狀態下。其次，較高的相對濕度下，黃曲霉毒素容易產生。所以，控制環境的相對濕度也是控制黃曲霉毒素產生的方法之一。另外，及時清理霉變粒也是一個行之有效的方法。

3　展望

鑒于AFT的毒性及在食品中的廣泛污染，世界各國相繼建立或正在改進檢測該毒素的方法。縱觀其發展趨勢，主要有兩個發展方向，即對現有方法的改進和新方法的開發。在現有方法的改進方面，利用免疫學原理建立的檢測方法及速測技術，如酶聯免疫法、酶聯免疫試劑盒等，將會是以后發展的主流，并將在黃曲霉毒素的檢測中占主要地位；在新方法的發方面，對可能產生黃曲霉毒素的原材料，如谷物中的霉變粒，進行監控方法的研發將會是一個發展趨勢。

參考文獻：

［1］蔡其洪.黃曲霉毒素檢測方法的應用及進展［J］.現代食品科技，2005，22（2）:233-236.

［2］張宸，岳田利，高振鵬，王軍.食品中黃曲霉毒素B1檢測方法研究進展［J］.農產品加工，2008，（7）:18-21.

［3］劉艷麗，程安春，汪銘書.黃曲霉毒素及其檢測方法的研究進展［J］.黑龍江畜牧獸醫，2006，（6）:15-17.

［4］柳潔，何碧英.高效液相色譜法測定食品中黃曲霉毒素的方法研究［J］.現代預防醫學，2002，29（2）:137-139.

［5］肖紫蘭，羅超，李逢慧，等.黃曲霉毒素定性與定量檢測方法概述［J］.飼料博覽2008，（12）:23-24.

［6］林裕.高效液相色譜法測定食品中黃曲霉毒素［J］.中國熱帶醫學，2006，6（4）:677-678

［7］鄭榮，毛丹，王柯，等.基質固相分散色譜法檢測辣椒產品中的黃曲霉毒素［J］.色譜，2005，25（6）:610-613.

［8］高軍俠，萬吳雷，劉作新.Florisil柱凈化玉米.水稻及糙米［J］.2005，37（2）:101-104.

［9］羅超，李逢慧.黃曲霉毒素檢測方法研究概況［J］.動物醫學進展，2008，（29）:37-39.

［10］張岑，曾慶孝，朱志偉，等.黃曲霉毒素的快速檢測方法“科技創新與食品產業可持續發展”學術研討會暨2008年廣東省食品學會年會論文集:210-215.

［11］趙飛，焦彥朝，連賓，等.黃曲霉毒素檢測方法的研究進展［J］.貴州農業科學，2006，34（5）:123-126.

［12］柳潔，何碧英，孫俊紅.ELISA和免疫親和柱HPLC方法測定糧油食品中黃曲霉毒素B1［J］.現代預防醫學，2005，32（6）:653-655.

［13］熊麗，陸琳，羅超，等.黃曲霉毒素的危害及檢測方法的研究進展［J］.畜牧獸醫雜志，2008，27（3）:39-40.

［14］馬良，張宇昊，李培武.LIF-HPCE法檢測食品中的黃曲霉毒素B1 ［J］.食品科學，2009，30（10）:135-139.

【Abstract】Aflatoxins，a group of toxins structurally related to secondary metabolites are produced by some fungal strains and to have extremely toxic，potent carcinogenic and ubiquitous in the environment.Along with technological development and national attention，its detection methods have also developed continuously.The methods and application of HPLC、TCL、Immunoassay and other detecting methods were discussed in the paper，and the control measures were introduced briefly.The prospect of detecting methods of AFT was also explained for the future.

【Key words】AFTDetectionControl