乙型肝炎病毒X蛋白通過DNMT3A誘導肝癌細胞RUNX3基因高甲基化

林萬松，林 潔，林巧燕，周智鋒，李潔羽，葉韻斌

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乙型肝炎病毒X蛋白通過DNMT3A誘導肝癌細胞RUNX3基因高甲基化

林萬松1，林 潔2，林巧燕1，周智鋒1，李潔羽1，葉韻斌1

目的 研究肝癌細胞中乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)對抑癌基因Runt相關轉錄因子3(RUNX3)表達的影響及相關作用機制，探討乙肝病毒促肝癌發生的表觀遺傳調控。方法 HBx重組表達載體轉染5-aza-CdR處理或未處理的Huh7、HepG2肝癌細胞，Western Blot及RT-qPCR檢測RUNX3 的表達，分析RUNX3基因啟動子CpG島甲基化水平。合成DNA甲基轉移酶3A的小干擾RNA(siRNA_3A)單獨轉染或與HBx共轉染，檢測RUNX3的表達。PCR檢測21例手術切除的肝細胞癌新鮮組織標本HBx表達情況，比較HBx陰性與HBx陽性組織樣本間RUNX3的表達差異以及啟動子甲基化程度。結果 過表達HBx可導致肝癌細胞內RUNX3表達下調，且甲基轉移酶抑制劑5-aza-CdR可完全阻斷HBx對RUNX3的抑制作用。HBx誘導RUNX3基因啟動子CpG島發生高甲基化，但不影響DNA甲基轉移酶的表達。siRNA_3A轉染肝癌細胞后，RUNX3 mRNA與蛋白表達均顯著上調；其與HBx共轉染后，逆轉了單獨HBx對RUNX3的抑制作用。HBx陽性的肝癌組織中RUNX3 mRNA表達水平較HBx陰性組低，且RUNX3啟動子甲基化程度也相對較高。結論 HBx通過促進RUNX3啟動子區域發生高甲基化而抑制其表達，且這一過程是由DNMT3A所介導的。

乙型肝炎病毒X蛋白；肝細胞癌；Runt相關轉錄因子3；DNA甲基轉移酶3A；甲基化

乙型肝炎病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein，HBx)是乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)編碼的的一個重要調節因子，具有多功能性，在HBV致肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)發生發展過程中起著關鍵作用[1]。HBx可通過反式激活功能誘導多種病毒和宿主細胞基因的轉錄，通過調節信號轉導通路，參與了氧化應激、DNA修復、蛋白降解、細胞周期和凋亡等細胞活動過程[2-3]。此外，研究報道HBx能夠誘導宿主基因的表觀遺傳學改變，包括DNA甲基化修飾異常等[4-5]。Runt相關轉錄因子3(Runt-related transcription factor 3，RUNX3)隸屬于Runt 結構域轉錄因子家族，具有抑癌基因的功能，在包括HCC在內的多種實體瘤中均發現RUNX3基因由于啟動子高甲基化而表達受到抑制[6-7]，但其異常甲基化的分子機制有待深入分析。本文通過研究HBx對RUNX3表達的影響及相關作用機制，探討二者之間的聯系以及對HCC發病所起的作用。

1 材料與方法

1.1 細胞與主要試劑 Huh7和HepG2肝癌細胞株由福建省腫瘤醫院腫瘤免疫學研究室保存。DMEM高糖培養基、胎牛血清(美國Gibco公司)；X-tremeGENE HP DNA轉染試劑、逆轉錄試劑盒、LightCycler 480 SYBR Green定量PCR試劑盒(美國Roche公司)；RUNX3單克隆抗體、DNMT1、DNMT3A、DNMT3B多克隆抗體(英國Abcam公司)；Xpress單克隆抗體、TRIzol試劑(美國Invitrogen公司)；β-actin多克隆抗體、HRP標記二抗(美國Cell Signaling Technology公司)；DNA提取試劑盒、EpiTect Bisulfite Kit亞硫酸氫鈉處理試劑(德國Qiagen公司)；5-aza-CdR(美國Sigma公司)。

1.2 標本 21例新鮮HCC標本取自2014-2015年福建省腫瘤醫院肝膽外科住院手術患者，術前均未接受放射和化學治療，術后均經病理學證實，組織離體后立即置液氮保存。

1.3 HBx重組表達載體構建 HBx全長克隆于真核表達載體pcDNA3.1/HisC，載體多克隆位點N端帶有Xpress多肽表位，HBx與Xpress融合表達。該重組表達載體命名為pcDNA3.1-HBx已構建完成[8]，由本實驗室保存。

1.4 細胞培養與轉染 Huh7和HepG2細胞以5%CO2、含10%胎牛血清的DMEM常規培養，轉染前24 h細胞用胰酶消化，按2×105個細胞每孔接種至6孔板中，轉染時細胞達50%～70%融合。轉染按X-tremeGENE HP DNA轉染試劑說明書操作，每次均設空白對照組以及陰性對照組。

1.5 RNA干擾(RNAi)實驗 DNMT3A小干擾RNA(siRNA_3A)及陰性對照siRNA_ctrl設計參照文獻[9]，序列如下(只列出正義鏈)：siRNA_3A：5′-CAGGAGATGATGTCCAACCC-3′；siRNA_ctrl：5′- CACGACATCATCTCGAACGC- 3′。單鏈寡核苷酸片段由上海生工生物公司合成，經退火后形成雙鏈siRNA，轉染細胞，終濃度為100 nmol/L，48 h后Western Blot檢測DNMT3A的表達。

1.6 RT-qPCR TRIzol試劑提取總RNA，經55 ℃ 30 min逆轉錄合成cDNA，實時定量PCR按試劑說明書配制反應液，在Roche LightCycler 480 PCR儀上運行，循環參數為95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個循環。RUNX3引物序列：上游：5′-CAGGCAATGACGAGAACT-3′，下游：5′-GGTTGGTGAACACAGTGA-3′，擴增片段長度為147 bp。

1.7 PCR擴增HCC組織HBx基因 PCR擴增HBx引物設計依據文獻[10]，使用普通Taq DNA聚合酶，PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離。

1.8 Western Blot 細胞加入RIPA裂解液提取總蛋白，BCA蛋白定量。取25 μg變性總蛋白經10%SDS-PAGE凝膠電泳分離后電轉移至PVDF膜。膜以3%BSA室溫封閉2 h，加相應的一抗4 ℃孵育過夜，各抗體稀釋濃度分別為：RUNX3(1∶500)，DNMT3A(1∶500)，Xpress(1∶1 000)，β-actin(1∶2 000)。PVDF膜經TBST漂洗后加入HRP標記的二抗(1∶3 000)孵育2 h，加入化學發光底物并置于Bio-Rad ChemiDoc XRS成像系統進行顯影與圖像分析。

1.9 甲基化特異性PCR(Methylation Specific PCR，MSP) MSP實驗參照文獻[11]，按試劑盒說明提取基因組DNA并進行亞硫酸鹽轉化及純化，合成針對RUNX3啟動子區域-271 bp至-52 bp的甲基化與非甲基化特異性引物，并分別進行PCR擴增，產物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳分離，凝膠置于Bio-Rad ChemiDoc XRS成像系統進行拍照并掃描DNA條帶灰度值。

2 結 果

2.1 HBx可抑制肝癌細胞中RUNX3的表達 3 μg的pcDNA3.1-HBx或空載體對照pcDNA3.1分別轉染Huh7細胞，48 h后提取細胞總蛋白，Western Blot檢測RUNX3蛋白水平。與pcDNA3.1組比較，HBx組的RUNX3蛋白表達水平顯著下調(t=12.036，P<0.01)，見圖1A。細胞加入終濃度為5 μmol/L的5-aza-CdR處理20 h后，再行上述轉染實驗，48 h后提取總RNA，RT-qPCR結果顯示5-aza-CdR處理后，RUNX3 mRNA的表達顯著高于單獨HBx(未加藥)組(t=17.120，P<0.01)，見圖1B。另外，在HepG2細胞中重復上述實驗，亦獲得類似的結果。以上結果表明過表達HBx可抑制肝癌細胞中RUNX3的表達，且甲基轉移酶抑制劑可阻斷該抑制作用，提示其作用機制可能與表觀遺傳相關。

注：* * P<0.01Note: * * P<0.01A：Western Blot檢測RUNX3表達，β-actin為內參照；B：RT-qPCR檢測RUNX3 mRNA水平A: The RUNX3 protein was detected by western blot; B: The RUNX3 mRNA was detected by RT-qPCR.圖1 過表達HBx抑制肝癌細胞RUNX3的表達Fig.1 Ectopic HBx inhibited the expression of RUNX3

2.2 HBx誘導RUNX3啟動子發生高甲基化 培養Huh7細胞進行上述步驟1的基因轉染實驗，48 h后提取細胞基因組DNA用于MSP實驗。結果顯示，對照組DNA甲基化與非甲基化條帶均存在，提示RUNX3啟動子在肝癌細胞中有部分發生甲基化；與對照組比較，HBx過表達組甲基化條帶灰度值明顯增強(t=9.982，P<0.01)，非甲基化條帶灰度值降低(t=10.337，P<0.01)，見圖2。MSP結果表明過表達HBx后RUNX3基因啟動子區發生了高甲基化。另外，細胞過表HBx后，Western Blot檢測DNMT1、 DNMT3A和DNMT3B的表達，結果顯示，3種甲基轉移酶蛋白表達均沒有發生明顯變化，見圖3。

注：U表示未甲基化，M表示甲基化Note: U: unmethylated, M: methylated圖2 MSP法檢測RUNX3基因啟動子CpG島甲基化水平Fig.2 Methylation of RUNX3 promoter CpG island was evaluated by methylation specific PCR

圖3 過表達HBx不影響肝癌細胞DNMTs的表達 Fig.3 Influence of ectopic HBx on the expression of DNMTs

2.3 DNMT3A介導HBx對RUNX3的抑制作用 siRNA_3A轉染Huh7、HepG2細胞后，可顯著下調DNMT3A蛋白表達(與對照組比較，t值分別為20.486和18.058，P值均<0.01)，表明siRNA能有效干擾DNMT3A，見圖4A。培養Huh7細胞進行共轉染實驗，共轉染分4個組：A組pcDNA3.1+siRNA_ctrl、B組pcDNA3.1+siRNA_3A、C組HBx+siRNA_ctrl、D組HBx+siRNA_3A。提取細胞總RNA和總蛋白，RT-qPCR檢測RUNX3 mRNA水平，Western Blot檢測RUNX3蛋白水平。與A組比較，B組的RUNX3 mRNA與蛋白表達均顯著上調(t值分別為13.574和12.728，P值均<0.01)，C組的RUNX3 mRNA與蛋白表達均顯著下調，同結果1相似(t值分別為10.337和10.895，P值均<0.01)；D組與C組比較，RUNX3 mRNA與蛋白表達均顯著上調(t值分別為16.124和14.858，P值均<0.01)，且B、D組間無顯著差異(t值分別為1.910和2.135，P值均>0.05)，見圖4B、4C。在HepG2細胞中重復上述共轉染實驗，獲得類似的結果。此外，我們還合成了siRNA_DNMT1及siRNA_DNMT3B，分別與HBx共轉染，結果發現干擾DNMT1或DNMT3B的表達并不能逆轉HBx對RUNX3的抑制作用。體外實驗表明，HBx誘導RUNX3啟動子高甲基化從而抑制RUNX3的表達，且干擾DNMT3A(而非DNMT1或DNMT3B)的表達可完全阻斷該抑制作用，提示HBx可能通過DNMT3A介導RUNX3基因啟動子異常甲基化。

2.4 HCC組織中HBx與RUNX3表達相關性 為了進一步證實體外實驗的結果，我們研究臨床標本中HBx與RUNX3的相關性。PCR擴增21例HCC新鮮組織標本HBx基因，其中7例為陰性，14例為陽性，見圖5A。將標本分為HBx陰性組與HBx陽性組，RT-qPCR檢測組兩組中RUNX3的表達并進行統計學分析，實驗結果顯示HBx陽性組RUNX3 mRNA的表達水平較HBx陰性組低(t=2.700，P<0.05)，見圖5B。選取HBx陰性和陽性標本各1例，分別提取基因組DNA，MSP法檢測其RUNX3啟動子甲基化程度，如圖5C顯示，HBx陽性標本中RUNX3啟動子甲基化程度相對較高(t=4.717，P<0.05)。

注： * *P<0.01，siRNA_ctrl表示siRNA_control，siRNA_3A表示siRNA_DNMT3A

Note: * *P<0.01, siRNA_ctrl: siRNA_control, siRNA_3A: siRNA_DNMT3A

A：Western Blot檢測siRNA對DNMT3A干擾的效率；B、C：Western Blot及RT-qPCR檢測RUNX3表達

A： The DNMT3A protein was detected by western blot in HCC cells transfected with siRNA_DNMT3A; B, C: The expression of RUNX3 was measured in HCC cells co-transfected with siRNA_DNMT3A and HBx.

圖4 DNMT3A介導肝癌細胞中HBx對RUNX3的抑制作用

Fig.4 HBx downregulates RUNX3 expression through DNMT3A in HCC cells

注：*P<0.05，U表示未甲基化，M表示甲基化

Note: *P<0.05, U: unmethylated, M: methylated

A：PCR擴增21例HCC新鮮組織標本HBx基因，數字1-21代表標本編號；B： RT-qPCR檢測HCC組織中RUNX3的表達；C：MSP法檢測HCC組織中RUNX3基因啟動子CpG島甲基化水平

A： HBx was detected by PCR in 21 HCC tissues; B: To analyzed the transcription of RUNX3 between HCC tissues with HBx negative and tissues with HBx positive by RT-qPCR; C: The methylation of RUNX3 promoter CpG island was evaluated by methylation specific PCR in HCC tissues with HBx negative or with HBx positive.

圖5 RUNX3在HBx陽性及陰性HCC組織中的差異表達及啟動子甲基化比較

Fig.5 Expression and methylation of RUNX3 were analyzed in HCC tissues

3 討 論

染色質異常貫穿于腫瘤形成及進展的各個階段，其中最具特征的就是通過表觀遺傳學改變，尤其是基因啟動子區域的DNA高甲基化，在轉錄水平沉默某些調節細胞重要功能的基因表達。已有證據表明，病毒基因是調控DNA甲基化的一個關鍵因子。多種病毒，如人乳頭瘤病毒、EB病毒所誘導的DNA甲基化是宮頸癌、胃癌等病毒相關性癌癥的始動機制[12-13]，猿猴病毒40T、EB病毒以及卡波氏肉瘤相關皰疹病毒等能夠通過多種途徑導致DNMTs的異常改變[14-16]。HBx相較于HBV中的其他組分，更常整合到宿主基因組中，并隨著宿主基因持續復制，這一過程發生在HCC 形成之前，是促進HCC發生的一個重要生物學事件[17-18]。HBx具有廣泛的調節作用，其確切的分子機制有待深入發掘。

RUNX3的缺失與細胞分化調節異常及腫瘤形成有關。在包括HCC在內的多種實體瘤中，因高甲基化而導致的RUNX3失活非常普遍。研究HBx與HCC中RUNX3甲基化調控間的關系，將會為理解HBx參與HCC發生發展機制提供新的思路。

本研究通過體外轉染實驗發現，過表達HBx可抑制肝癌細胞RNNX3 mRNA及蛋白表達，且誘導RUNX3啟動子發生高甲基化；同時臨床樣本中也發現HBx陽性的HCC組織RUNX3表達水平較HBx陰性組低，且RUNX3啟動子甲基化程度相對較高。提示HBx可促進RUNX3基因高甲基化從而抑制RUNX3的表達。這與之前的報道相符，RUNX3的表達確實受到了某些病毒相關蛋白的調控[19-20]。

另外，本研究發現干擾肝癌細胞DNMT3A的表達，可上調RUNX3水平； DNMT3A siRNA與HBx共轉染可逆轉單獨HBx對RUNX3的抑制作用，使RUNX3回復上調表達，表明DNMT3A介導了HBx對RUNX3的抑制作用。DNMT3A屬于從頭DNA甲基化轉移酶，在腫瘤進展的早期階段，特定基因啟動子區域的CpG島高甲基化和非CpG島的低甲基化均有賴于從頭DNMTs的作用[21]。但HBx并不是通過上調DNMT3A而促進RUNX3高甲基化的。Zheng等報道，肝癌細胞中HBx可與DNMT3A發生直接相互作用，且HBx通過該相互作用促進或者抑制DNMT3A結合至某些抑癌或促癌基因啟動子區[10]。因此我們推測HBx也可能通過該分子機制調控RUNX3的表達?？傊?，本文初步闡明了HCC中HBx對抑癌基因RUNX3表達的影響及相關作用機制，豐富了對表觀遺傳學調控HCC發生發展的認識，為利用表觀遺傳學原理治療HCC提供了新的思路。

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Ye Yun-bin, Email: zjyunbin@189.cnSupported by the National Natural Science Foundation of China (No. 81301444) and the Program for Young Teacher Education Research of Fujian Province (No. JB13128)

Hepatitis B virus X protein induced hypermethylation of RUNX3 through DNMT3A in HCC cells

LIN Wan-song1, LIN Jie2, LIN Qiao-yan1, ZHOU Zhi-feng1, LI Jie-yu1, YE Yun-bin1

(1.TumorImmunologyLaboratoryofFujianProvincialCancerHospital,FujianKeyLaboratoryofTranslationalCancerMedicine,Fuzhou350014,China;2.PathologyDepartment,FujianProvincialHospital,theShengliClinicalMedicalCollegeofFujianMedicalUniversity,Fuzhou350001,China)

We investigated the effect of hepatitis B virus X protein (HBx) on runt-related transcription factor 3 (RUNX3) in hepatocellular carcinoma (HCC). The expression of RUNX3 was detected by quantitative real-time PCR and western blot as well as the methylation of RUNX3 promoter CpG island was evaluated by methylation specific PCR in HCC cells transfected with HBx recombinant plasmids. The small interfering RNA (siRNA) targeting DNA methyltransferase 3A (DNMT3A) were co-transfected with HBx recombinant plasmids into HCC cells, and then the expression of RUNX3 was measured. In addition, the expression and methylation of RUNX3 were analyzed in 21 HCC tissues. Result showed that ectopic HBx inhibited the expression of RUNX3 and induced hypermethylation of RUNX3 CpG island in HCC cells. Furthermore, this inhibitory effect was abrogated by DNMT3A siRNA. The transcription of RUNX3 was higher in HCC tissues with HBx negative than tissues with HBx positive. But the methylation of RUNX3 CpG island exhibited the opposite trend. Our data indicate that HBx may downregulate the expression of RUNX3 through epigenetic mechanism.

Hepatitis B virus X protein; hepatocellular carcinoma; runt-related transcription factor 3; DNA methyltransferase 3A; methylation

國家自然科學基金青年科學基金項目(No. 81301444)和福建省中青年教師教育科研項目(No. JB13128)聯合資助

葉韻斌，Email：zjyunbin@189.cn

1.福建省腫瘤醫院腫瘤免疫學研究室，福建省腫瘤轉化醫學重點實驗室，福州 350014；

2.福建省立醫院病理科，福建醫科大學省立臨床醫學院，福州 350001

10.3969/j.issn.1002-2694.2016.08.007

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A

1002-2694(2016)08-0717-06

2016-03-09；

2016-05-08