耐酸性α-淀粉酶產生菌的篩選及其產酶條件優化

任世英，邵 奎，李 雯，張 威，劉 飛

（1.淮陰工學院生命科學與食品工程學院，江蘇淮安223003；2.淮陰工學院化學工程學院，江蘇淮安223003）

科學實驗研究

耐酸性α-淀粉酶產生菌的篩選及其產酶條件優化

任世英1，邵 奎1，李 雯1，張 威1，劉 飛2*

（1.淮陰工學院生命科學與食品工程學院，江蘇淮安223003；2.淮陰工學院化學工程學院，江蘇淮安223003）

為了分離得到飼料用耐酸性α-淀粉酶的菌株，從食堂排污口取土樣，篩選到一株耐酸（pH=4）且產α-淀粉酶的菌株，并對其形態特征、培養特征、生理生化特征、酶學性質及產酶條件進行研究。結果表明：菌體呈桿狀，革蘭氏染色陽性，胞內形成異染粒和PHB，接觸酶、淀粉水解、卵磷脂酶試驗呈陽性，反硝化試驗、熒光色素呈陰性。根據菌體形態、菌落特征及部分生理生化特性，將其初步鑒定為芽孢桿菌屬，即Bacillus sp.SD-1。通過單因素試驗對菌株的最適產酶溫度及pH進行優化，培養溫度為43℃，pH為4.5，發酵60 h，酸性α-淀粉酶活力達到74.6 U/mL。

耐酸性；a-淀粉酶產生菌；芽孢桿菌屬

酸性α-淀粉酶是指可在酸性條件下水解淀粉的酶，在低pH值條件下以隨機方式切斷淀粉分子內的α-1，4糖苷鍵，水解產物為低聚糖、麥芽糖和糊精等（潘濤，2010；賀勝英等，2010）。酸性α-淀粉酶廣泛應用于酸性條件下淀粉原料的加工，如高麥芽糖漿的制備、發酵飲料和青貯飼料的生產、工業副產品的加工以及廢料的處理等（謝建華等，2011；劉雅琴等，2010）。目前，國內外市場中常用的淀粉酶為中溫、高溫以及堿性α-淀粉酶，其最適pH值在6.0～10.0，在酸性條件下，其酶活性明顯降低，甚至失去活性（吳茜茜，2012；李勃，2009）。隨著我國淀粉質原料深加工工業的發展，工藝條件的不斷改變，一些淀粉原料深加工工藝需要在較低的pH條件下進行。所以，開發新型耐酸性α-淀粉酶迫在眉睫（魏姍姍，2014；石方方，2012）。

自從1963年日本學者Yasuji Minoda發現黑曲霉可以產生耐酸性α-淀粉酶后，人們對耐酸性α-淀粉酶進行了廣泛的研究，并相繼發現多種微生物如枯草桿菌、白曲霉、青霉、酵母菌均可產生耐酸性α-淀粉酶，但存在的主要問題是所選菌株的產酶活力不高以及缺乏可靠的安全性（賀勝英等，2010；洪新，2010）。

本試驗從食堂排污口土壤中篩選出耐酸α-淀粉酶產生菌，并對其生長特性、生理生化特性進行研究，最后進行菌種鑒定，為耐酸性α-淀粉酶產生菌的研究提供新材料，為其在飼料工業中的廣泛應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源菌株來自食堂排污口表層土樣。

1.1.2 培養基篩選培養基：牛肉膏0.3%，蛋白胨1%，NaCl 0.5%，瓊脂2%，可溶性淀粉2%，pH=4。

種子培養基和發酵（產酶）培養基：可溶性淀粉0.5%，蛋白胨1.0%，CaCl2·6H2O 0.02%，MnSO40.01%，KH2PO40.05%，MgSO40.03%，FeSO4·7H2O 0.01%，pH=4。

1.2 方法

1.2.1 篩選方法取食堂排污口表層土樣，稱取樣品10 g置于裝有90 mL無菌水及數顆無菌玻璃珠的三角瓶中，劇烈振蕩10 min，使樣品顆粒分散均勻，靜置5 min，取懸液1 mL置于滅菌平板，倒入約25 mL篩選培養基并搖晃均勻，凝固后置入37℃恒溫箱培養。菌體生長后，挑取透明圈直徑（D）與菌落直徑（d）比值較大的菌落進一步分離純化。

1.2.2 酶活測定

1.2.2.1 粗酶液的制備將初篩得到的菌株接入種子培養基，37℃、160 r/min搖床培養24 h。種子培養液以10%的接種量接種于產酶培養基，相同條件下培養48 h，發酵液4000 r/min離心10 min，上清液為粗酶液，取上清液測定耐酸性α-淀粉酶的活性（安弋等，2010）。

1.2.2.2 酶活測定方法1%的底物溶液：稱取1 g可溶性淀粉，用少量pH=5.0的檸檬酸-磷酸緩沖液溶解，然后加入到煮沸的該緩沖液中完全溶解，配制成1%、pH=5.0的淀粉底物溶液；0.005%的碘-碘化鉀溶液：稱取0.25 g碘、2.5 g碘化鉀，用研缽研磨后用水溶解，定容至500 mL。

取10 mL的底物溶液放入一個試管中，50℃水浴保溫10 min后，加入粗酶液1 mL，混勻，精確保溫10 min，吸取0.5 mL混合液，加入盛有10 mL、0.1 mol/L的HCl的試管中，然后再取該混合液0.5 mL，加入盛有10 mL的碘液試管中搖勻，用分光光度計于660 nm下測定吸光值（李習等，2014）。對照管用同樣的方法測定，只是將粗酶液事先于沸水中煮10 min后再加入，以蒸餾水作為比色的參比。

酶活力定義：在上述條件下，反應10 min使 1%淀粉溶液顯藍強度降低1%所需酶量為1個酶活力單位（U）（王彩瀾等，2012）。

式中：D0為空白值吸光度；D為主值吸光度；100為系數，%。

1.2.3 耐酸性α-淀粉酶產生菌株部分生理生化指標鑒定參照《伯杰氏細菌系統鑒定手冊》第八版測定。

1.2.4 產酶條件的優化

1.2.4.1 培養溫度的優化菌株SD-1以2%接種量接種于產酶培養基，分別在34、37、40、43、50℃，pH=4，180 r/min條件下培養48 h，發酵結束后離心取上清，測定吸光度值，計算酶活性，以確定適宜產酶的發酵溫度。

1.2.4.2 pH的優化菌株SD-1以2%接種量接于pH=3.5、4、4.5、5、5.5的發酵培養基，在優化好的培養溫度下，180 r/min培養48 h，發酵結束后離心取上清，測定吸光度值，計算酶活性，以確定適宜的產酶pH。

1.2.5 耐酸性α-淀粉酶產生菌株的酶活曲線菌株SD-1以2%接種量接于發酵培養基，在優化好的培養溫度和pH下，180 r/min培養，每10 h取樣，離心取上清，測定吸光度值，計算酶活性，繪制產酶曲線。

2 結果與分析

2.1 菌落形態及部分生化指標測定結果將菌株SD-1稀釋涂布篩選平板，置于24℃培養箱，培養48 h，觀察其菌落形態。菌落呈淺黃色，正反面顏色相同，大小為5～20 mm，表面光滑濕潤，圓形，邊緣整齊，形成明顯的透明圈，從側面看沒有丘狀突起，其部分生理生化特性見表1。

表1 菌株SD-1部分生理生化特性鑒定結果

2.2 產酶條件的優化

2.2.1 不同培養溫度的影響由圖1可見，在培養溫度為43℃時，相對酶活較高，達到78%，所以確定菌株的較適培養溫度為43℃。

圖1 不同培養溫度對菌株SD-1產酶活性的影響

2.2.2 pH的影響菌株SD-1接種于pH 3.5、4、4.5、5、5.5發酵培養基，在43℃、180 r/min培養48 h，發酵結束后離心取上清，測定吸光度值，計算酶活性，結果如圖2所示。在pH為4.5時，相對酶活較高，達到75%，所以確定菌株的較適pH為4.5。

圖2 不同pH值對菌株SD-1產酶活性的影響

2.3 耐酸性α-淀粉酶產生菌株SD-1的酶活曲線由圖3可見，該菌株在60 h時，發酵液中酶活力達到74.6 U/mL，相對酶活達到最高81%，隨著培養時間延長，酶活力逐漸降低。

圖3 菌株SD-1的酶活曲線

3 討論

芽孢桿菌屬于益生菌，被研制成各種形式的飼料級微生態制劑應用于畜牧生產中，其中枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）應用最廣泛，是一種革蘭氏陽性菌，具有耐高溫、能形成芽孢、穩定性強及產酶能力強等特點（劉明超，2015）。動物攝入芽孢桿菌后，在胃腸道特定部位黏附，定植及生長，在一定程度上對病原微生物起到抑制作用，促進胃腸道微生態平衡，從而利于動物健康生長。芽孢桿菌能產生多種動物自身都不能產生的酶類，說明其作為微生態制劑具有巨大的潛力。如枯草芽孢桿菌及地衣芽孢桿菌均具有較強的分泌蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶以及許多能夠分解復雜的碳水化合物的酶，這些酶能夠降解植物性有機化合物，同時可以降解蛋白質、甘油三酯、淀粉、果膠等營養物質，從而提高畜禽對有機物的利用率（姜芬，2016）。本試驗篩選到的芽孢桿菌對酸有很好的耐受性，粗提a-淀粉酶的活性也較高，菌株對溫度的耐受性也較高，需進一步對其進行改造，提高酶的活性，同時分離純化酶，對酶的結構和特性進行研究，以期能在飼料工業得到廣泛應用。

4 結論

本試驗篩出一株耐酸性a-淀粉酶產生菌株，即Bacillus sp.SD-1，其最適產酶pH為4.5，最適產酶培養溫度為43℃，該研究為今后淀粉酶的分離純化提供了重要依據，后期需對該菌所產a-淀粉酶的特性進行研究，以實現其在飼料工業中的應用。

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In order to obtain acid resistant strains producing α-amylase for the application in feed industrial field. Clear circle was used to initially screen desired strains at pH 4.SD-1 was chosen as experimental strain owning to its higher ratio of dissolving circle diameter to colony diameter.Strain SD-1 was rod，G+.Test results of metachromatic granule staining，PHB，catalase，amylolysis，lecithinase were positive.Test results of denitrification and fluorchrome were negative. According to its cell and colony morphology，physiological and biochemical properties，strain SD-1 belongs to genus Bacillus，namely Bacillus sp.SD-1.Optimization of higher α-amylase production conditions：43℃，pH 4.5，fermentation for 60 h，the activity of α-amylase was up to 74.6 U/mL.

acid resistant；bacterium-producing α-amylase；Bacillus

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20161703

S816.6

A

1004-3314（2016）17-0010-03

國家自然科學基金項目（51308245）；江蘇省淮安市科技計劃項目（HAN2015026）；江蘇省生物質轉化與過程集成工程實驗室開放課題（JPELBCPL2013004和JPELBCPL2014006）

*通訊作者