二苯基庚烷A干預RAW264.7細胞炎癥模型甘油磷脂的UPLC-Q/TOF MS分析

肖雪蓉，佘玉奇，張國改，吳 霞，馮毅凡

(廣東藥科大學 中心實驗室，廣東 廣州 510006)

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二苯基庚烷A干預RAW264.7細胞炎癥模型甘油磷脂的UPLC-Q/TOF MS分析

肖雪蓉，佘玉奇，張國改，吳 霞，馮毅凡*

(廣東藥科大學 中心實驗室，廣東 廣州 510006)

對RAW264.7細胞在不同狀態(正常、炎癥、給藥)下的甘油磷脂成分進行分析，尋找相關的潛在病理藥理標志物，闡明二苯基庚烷A在抗炎過程中對甘油磷脂代謝的影響。實驗分為空白組(C)、炎癥模型組(L)、二苯基庚烷A給藥組(D)和布洛芬給藥組(B，陽性對照藥組)4組。空白組和炎癥組給予新鮮培養基，給藥組分別給予新配含20 μg/mL二苯基庚烷A和100 μg/mL布洛芬的培養基，1 h后，炎癥模型組和給藥組按終濃度為0.5 μg/mL加入脂多糖(LPS)培養，24 h后，運用修飾后的Bligh-Dyer方法提取不同狀態下RAW264.7細胞的甘油磷脂成分，并通過超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜聯用技術(UPLC-Q/TOF MS)在正負離子模式下對甘油磷脂進行一級(MS)和二級(MS/MS)質譜分析。結合二級質譜裂解數據、元素組成、數據庫比對等方法鑒定磷脂成分，再通過主成分分析法(PCA)、偏最小二乘判別分析(PLS-DA)、正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)以及t檢驗篩選潛在的甘油磷脂生物標志物。結果顯示，炎癥組與空白組比較得到27個潛在病理標志物，二苯基庚烷A給藥組與炎癥組比較得到23個潛在藥理標志物，布洛芬給藥組與炎癥組比較得到17個潛在藥理標志物，主要包括磷脂酰膽堿(PC)、溶血磷脂酰膽堿(lysoPC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、溶血磷脂酰乙醇胺(lysoPE)。研究表明二苯基庚烷A在抗炎過程中引起了甘油磷脂代謝的明顯變化，而這些代謝變化與炎癥的發生發展密切相關。

炎癥；甘油磷脂；二苯基庚烷A；布洛芬；生物潛在標志物；超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜(UPLC-Q/TOF MS)

炎癥是機體對致炎因子的損傷所發生的一種以防御反應為主的基本病理過程。在正常情況下，炎癥的發生可殺滅病原體、限制感染擴散及修復組織損傷等。然而，過度的炎癥反應會造成組織損傷，器官功能障礙等危害機體[1-2]。如動脈粥樣硬化[3]、缺血/再灌注損傷[4]、支氣管哮喘[5]、糖尿病[6]、老年性癡呆[7]等均伴有炎癥的發生。因此，對炎癥機制的研究，對于各種炎癥性疾病的治療具有重要意義。

隨著脂質組學的誕生，對炎癥機制的研究逐漸轉移到脂質層面。脂質作為細胞膜的結構成分具有廣泛的生物功能，如激活和參與信號轉導途徑、維持電化學梯度和轉運蛋白等[8-9]。甘油磷脂作為脂質中的主要成分以及花生四烯酸的前體物質，其代謝紊亂也會導致炎癥的發生[10]。然而，目前從磷脂方面探討藥物對發生炎癥的影響并不多見。

二苯基庚烷類是山姜屬植物的主要有效成分，藥理作用廣泛，包括抗炎鎮痛、抗腫瘤、抗氧化等[11]。有文獻證明二苯基庚烷A可通過抑制NF-κB活性進而抑制誘導型一氧化氮合酶(iNOS)、環氧合酶2(COX-2)的表達，最終達到抗炎鎮痛的作用[12-13]。布洛芬是臨床上廣泛應用的非甾體抗炎藥，其被認為主要通過抑制COX-2的活性而產生抗炎機制[14-15]，然而，Manrique-Moreno等[16]也證明了布洛芬可與細胞膜上脂質層反應，從而影響細胞膜上的離子通道、受體和酶等。但是，對于二苯基庚烷A和布洛芬在抗炎過程中對甘油磷脂代謝的影響卻鮮見報道。

為闡明二苯基庚烷A在抗炎過程中對甘油磷脂代謝的影響，本文應用超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜聯用技術(UPLC-Q/TOF MS)，分別對正常狀態、炎癥狀態、給藥狀態下RAW264.7細胞甘油磷脂成分進行快速分析鑒定，利用PCA,PLS-DA,OPLS-DA以及t檢驗等化學計量學方法進行數據分析，篩選出潛在的病理藥理標志物，初步探討了二苯基庚烷A在抗炎過程中對甘油磷脂代謝的影響。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

UPLC-Q/TOF MS液質聯用儀和UPLC BEH-C18柱(2.1 mm×50 mm,1.7 μm)均為美國Waters公司產品；-86 ℃超低溫冰箱(中科美菱公司)；HF90CO2培養箱(上海力申科學儀器有限公司)；SW-CJ-1FD超凈臺(蘇凈安泰)；顯微鏡。

高糖培養基(DMEM)、胎牛血清(FBS)、0.25%胰蛋白酶(Gibco公司)；雙抗(北京康貝源科技有限責任公司)；磷酸鹽緩沖液(PBS，Hyclone公司)；甲醇(色譜純，CNW公司)；乙腈(色譜純，CMY公司)；異丙醇(色譜純，Merk公司)；乙酸(色譜純，Aladdin公司)；醋酸銨、氯仿(分析純)；二苯基庚烷A(本課題組前期分離純化獲得)；布洛芬、脂多糖(LPS)、亮氨酸腦啡肽(Sigma公司)；甘油磷脂標準品：PC(16∶0/18∶1)，PC(16∶0/0∶0)，PE(18∶0/0∶0)，PC(18∶1/0∶0)(Avanti polar lipids公司)。

1.2 溶液的配制

含二苯基庚烷A或布洛芬培養基的配制：精密稱取適量二苯基庚烷A和布洛芬粉末，移取少量DMSO溶解，加入空白培養基，配制成1 mg/mL的含藥培養基母液。精密移取適量含藥培養基母液，加空白培養基配制成濃度為20 μg/mL的二苯基庚烷A培養基以及100 μg/mL的布洛芬培養基(DMSO不超過藥物培養基總體積的0.1%)。

LPS的配制：精密移取1 mL PBS加入裝有1 mg LPS的棕色玻璃瓶中，超聲溶解混勻，完全轉移至50 mL無菌離心管中，加入39 mL PBS，超聲混勻，即配成25 μg/mL的LPS母液，用Eppendorf管分裝，-20 ℃保存備用。

磷脂標準品溶液的配制：精密稱取各甘油磷脂標準品，用甲醇溶解配成10 μg/mL的溶液，轉移至進樣瓶中備用。

1.3 細胞樣品的制備

本實驗分為空白組(C)、炎癥模型組(L)、二苯基庚烷A給藥組(D)和布洛芬給藥組(B，陽性對照藥組)，共4組，每組6個平行樣。以2×106/皿將細胞接種至60 mm培養皿中，輕輕搖勻，置CO2培養箱培養12 h后進行換液，給藥組分別更換為新配含20 μg/mL的二苯基庚烷A以及100 μg/mL的布洛芬培養基，對照組及炎癥模型組更換為新鮮的空白培養基(含與給藥組等量的DMSO)，藥物干預1 h后，炎癥模型組及給藥組加入LPS，使其終濃度為0.5 μg/mL，空白組加入等量的PBS，培養24 h后，進行細胞甘油磷脂的提取。

1.4 脂類成分的提取

采用修飾后的Bligh-Dyer方法提取RAW264.7細胞的脂質成分，整個提取過程需在4 ℃以下操作。具體提取過程如圖1。

圖1 RAW264.7細胞脂類成分的提取Fig.1 The extraction of lipids of RAW264.7 cells

1.5 UPLC-Q/TOF MS

色譜條件：UPLC BEH-C18柱(2.1 mm×50 mm,1.7 μm)；柱溫：50 ℃；進樣量：5 μL；流速0.3 mL/min；curve=7。流動相：A為含10 mmol/L乙酸銨的0.25%乙酸水溶液，B為含10 mmol/L乙酸銨和0.25%乙酸的乙腈-異丙醇(1∶1) 混合溶液。梯度洗脫條件：0～4 min，61%～81.4% B；4～20 min，81.4%～90% B；20～21 min，100% B；21～24 min，100% B。

質譜條件：以ESI為離子源在正、負離子模式下采集數據，以500 ng/mL亮氨酸-腦啡肽為參照進行實時質量數校正，其在正、負離子模式下的質荷比分別為m/z556.277 1和m/z554.261 5。質量掃描范圍為420～950 Da。正、負離子一級質譜參數：毛細管電壓：3 000 V；錐孔電壓：30 V；萃取錐孔電壓：1.0 V；離子源溫度：100 ℃；去溶劑溫度：300 ℃，碰撞能量：6 V；離子能量：1.0 V，錐孔氣體流速：50 L/h,脫溶劑氣體流速：500 L/h。二級質譜參數：不同種類的甘油磷脂成分所需碰撞能量不同，需根據其種類選擇合適的碰撞能量。

1.6 甘油磷脂成分的鑒定

借助Masslynx 4.1數據處理系統對目標分子量進行元素組成分析，限定誤差范圍為5 ppm以內，再結合二級質譜信息以及數據庫比對的方法鑒定RAW264.7細胞甘油磷脂成分。

1.7 數據處理

采用centroid模式進行數據采集，獲得直觀的總離子流色譜圖，通過Masslynx對數據進行預處理，將總離子流圖轉換成包含保留時間、質荷比、峰面積的數據矩陣，用于后續的數據處理。

經Masslynx預處理的數據導入Simca-p軟件進行PCA,PLS-DA,OPLS-DA分析。利用PCA,PLS-DA,OPLS-DA分別對空白組-炎癥模型組(C-L)、炎癥模型組-布洛芬給藥組(L-B)、炎癥模型組-二苯基庚烷A給藥組(L-D)進行兩兩比較分析，篩選出具有顯著變化的變量，并以能被上述3種分析方法重復提取的顯著變量作為潛在的磷脂標志物，再通過t檢驗，篩選出符合P<0.05的變量作為潛在的磷脂標志物。

2 結果與討論

2.1 RAW264.7細胞甘油磷脂的UPLC-Q/TOF MS

在正、負離子模式下對RAW264.7細胞甘油磷脂進行UPLC-Q/TOF MS掃描。由于磷脂成分的極性基團、Sn-1和Sn-2脂肪酸鏈復雜多樣，同一類中不同的磷脂可能保留時間相同或相近，色譜很難將其很好的分離，圖2為正離子模式下RAW264.7細胞甘油磷脂的總離子流色譜圖。由于所得到的每個色譜峰涵蓋多個甘油磷脂成分的信息，并且在每個樣品組的含量差異較大，人工處理數據較為困難，因此引入化學計量方法對數據進行處理，簡化了數據處理過程，極大地提高了數據處理效率。

圖2 4組細胞樣品甘油磷脂在正離子模式下的總離子流色譜圖

2.2 數據處理

2.2.1 主成分分析(PCA) PCA是無監督分析方法，可對多維空間的變量進行降維，并在最大限度減少信息丟失的情況下，有效提取發揮作用的主要成分[17]。通過優化，選擇最佳的標度化方法，對空白組-炎癥模型組(C-L)、炎癥模型組-二苯基庚烷A給藥組(L-D)、炎癥模型組-布洛芬給藥組(L-B)進行PCA分析。結果顯示，正、負離子模式下，組與組之間基本得以分離，表明組間樣品存在差異。圖3為正離子模式下各組的得分圖。

圖3 ESI+模式下最佳標度化處理的PCA得分圖

2.2.2 抗炎藥物干預RAW264.7細胞的甘油磷脂潛在標志物 PCA分析只能達到粗略的分型，獲得直觀可見的分型圖，為進一步具體化地篩選出造成組間差異的變量，需進行有監督的PLS-DA和OPLS-DA分析，在PLS-DA和OPLS-DA分析中，選擇在兩種方法中VIP值均大于1的變量作為候選標志物。將候選標志物進行t檢驗，篩選P值小于0.05的變量作為最終的潛在甘油磷脂生物標志物。通過空白組與炎癥模型組的對比，篩選得到潛在病理標志物，將二苯基庚烷A給藥組和布洛芬給藥組分別與炎癥模型組對比，篩選得到其潛在藥理標志物如表1～3所示。

從表1～3可以看到，炎癥模型組與空白組之間的潛在病理標志物和給藥組(二苯基庚烷A和布洛芬)與炎癥模型組之間的潛在藥理標志物主要包括磷脂酰膽堿(PC)、溶血磷脂酰膽堿(LysoPC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、溶血磷脂酰醇胺(LysoPE)。炎癥狀態下，有27個甘油磷脂類成分發生了顯著變化，而在二苯基庚烷A和布洛芬干預下分別有23個和17個潛在藥理標志物。通過潛在病理標志物和潛在藥理標志物的對比可得，兩者存在共同的磷脂類成分，并且在炎癥狀態和給藥狀態下的變化趨勢相反，說明RAW264.7細胞炎癥模型在藥物干預下，炎癥狀態下發生顯著變化的甘油磷脂類成分得以回調，恢復到正常狀態。同時也表明二苯基庚烷A在磷脂組學層面的抗炎作用機制與布洛芬相近。

表1 空白組與炎癥模型組之間的潛在病理標志物信息(C vs.L)

+：increase in content for the inflammation model group compared with control group;-：decrease in content for the inflammation model group compared with control group(+:與空白組相比，該物質在炎癥模型組呈上升趨勢；-:與空白組相比，該物質在炎癥模型組呈下降趨勢)

表2 炎癥模型組與二苯基庚烷A給藥組之間的潛在藥理標志物信息(L vs.D)

+：increase in content for the diphenylheptane A group compared with inflammation model group;-：decrease in content for the diphenylheptane A group compared with inflammation model group(+:與炎癥模型組相比，該物質在二苯基庚烷A給藥組呈上升趨勢;-：與炎癥模型組相比，該物質在二苯基庚烷A給藥組呈下降趨勢)

表3 炎癥模型組與布洛芬給藥組之間的潛在藥理標志物信息(L vs.B)

+：increase in content for the ibuprofen group compared with inflammation model group；-：decrease in content for the ibuprofen group compared with inflammation model group(+：與炎癥模型組相比，該物質在布洛芬給藥組呈上升趨勢；- ：與炎癥模型組相比，該物質在布洛芬給藥組呈下降趨勢)

2.3 討 論

炎癥過程中，炎癥介質主要由花生四烯酸(AA)代謝產生。正常情況下，游離AA的含量非常低，主要以磷脂的形式存在，而當細胞受到刺激時，AA會在磷脂酶A2的作用下從磷脂中釋放，發生級聯反應，產生大量的前列腺素類炎癥介質。然而，游離出的AA只有小部分用于合成前列腺素類物質，大部分在酰基轉移酶的作用下重新與溶血磷脂生成磷脂[18]。Rouzer等[19]測定了LPS誘導前后，與C20∶4代謝有關的甘油磷脂的結構以及RPMS巨噬細胞和RAW264.7巨噬細胞的脂質組成，進一步研究表明，含有C20∶4碳鏈的PC類是AA的主要來源，而烷酰基的PE類作為一種瞬時來源，可被快速補充。表1～3顯示，炎癥狀態下，含20∶4的甘油磷脂類，如LysoPC(20∶4/0∶0)，PC(14∶0/20∶4)，PC(16∶0/20∶4)，PC(16∶1/20∶4)，PC(15∶0/20∶4)的含量減少，給藥(二苯基庚烷A或者布洛芬)干預后，其含量增加。這主要是因為在LPS刺激下，花生四烯酸在環氧合酶的作用下生成大量的前列腺素類物質，而含有C20∶4碳鏈的PC和PE類作為花生四烯酸的前體物質在磷脂酶的作用下水解產生大量的AA，導致炎癥的持續發生。而當給藥干預之后，布洛芬和二苯基庚烷A通過干預COX2進而阻礙了AA的代謝，使得20∶4脂肪酸鏈合并入溶血磷脂形成含20∶4脂肪酸鏈的甘油磷脂類的含量增加。此外，研究表明[19-20]，受到適當的刺激，體內含20∶4的甘油磷脂成分減少時，伴隨著含16-C和18-C脂肪酸鏈的甘油磷脂類含量的增加。通過病理和藥理潛在標志物的對比分析發現，炎癥模型組中含16-C和18-C的甘油磷脂類，如PC(O-14∶0/18∶3)，PC(O-14∶0/16∶0)，PC(16∶0/20∶3)，PC(O-16∶0/16∶0)，PC(18∶1/20∶3),PC(18∶0/20∶2)的含量增加，給藥(二苯基庚烷A或者布洛芬)干預之后，其含量減少。

3 結 論

本實驗通過對不同狀態下的RAW264.7細胞進行甘油磷脂的UPLC-Q/TOF MS分析，并結合化學計量學進行數據處理發現，二苯基庚烷A和布洛芬在發揮抗炎作用的過程中導致細胞甘油磷脂發生顯著變化，而這些甘油磷脂成分的代謝與炎癥的發生發展密切相關。因此，這些磷脂可以作為抗炎藥物發揮作用的潛在標志物。

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Analysis of Glycerophospholipids in RAW264.7 Cell Inflammation Model Interfered by Diphenylheptane A with UPLC-Q/TOF MS

XIAO Xue-rong，SHE Yu-qi，ZHANG Guo-gai，WU Xia，FENG Yi-fan*

(Central Laboratory，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China)

The study aims to illustrate the effect of diphenylheptane A on the glycerophospholipids metabolism in the inflammatory process through analyzing glycerophospholipids components of RAW264.7 cells under different status(control，inflammation，administration) and screening potential pathological and pharmacological biomarkers.RAW264.7 cells were randomly divided into four groups：control group(C)，inflammation group(L)，diphenylheptane A(D)，ibuprofen(B，positive control).C and L were treated with fresh medium while D and B were treated with medium containing 20 μg/mL diphenylheptane A or 100 μg/mL ibuprofen，respectively.1 h later，lipopolysaccharide(LPS) was added to L，D and B at a final concentration of 0.5 μg/mL.24 h later，glycerophospholipids in RAW264.7 cells of four groups were extracted by modified Bligh-Dyer method and analyzed by ultra performance liquid chromatography tandem quadrupole time-of-flight mass spectrometry(UPLC-Q/TOF MS) in both positive and negative ion modes.Then，glycerophospholipids components were identified by combination of MS/MS fragment ions information，element composition in MassLynx 4.1 and the Lipid Maps database.Finally，potential pathological and pharmacological biomarkers were screened by unsupervised principal component analysis(PCA)，supervised partial least squares-discriminate analysis(PLS-DA)，supervised orthogonal partial least squares discriminate analysis(OPLS-DA)，and Student'st-test(P<0.05).The results showed that 27 potential pathological biomarkers were found by comparing C and L，23 potential pharmacological biomarkers were found by comparing D and L，and 17 potential pharmacological biomarkers were found by comparing B and L.The biomarkers mainly included phosphatidylcholine(PC)，lysophosphatidylcholine(lysoPC)，phosphatidylethanolamine(PE) and lysophosphatidylethanolamine(lysoPE).It was found that diphenylheptane A led to obvious changes of glycerophospholipids metabolism during the process of inflammation，which were closely related to the occurrence and development of inflammation.Key words：inflammation;glycerophospholipids;diphenylheptane A;ibuprofen;biomakers；ultra performance liquid chromatography tandem quadrupole time-of-flight mass spectrometry(UPLC-Q/TOF MS)

2016-03-30；

2016-04-26

國家自然科學基金資助項目(21275036，81202429)

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.10.002

O657.63；Q54

A

1004-4957(2016)10-1225-08

*通訊作者：馮毅凡，教授，研究方向：現代儀器分析技術在藥物分析中的應用，Tel：020-39352522，E-mail：tfengyf@163.com