酶功能化聚多巴胺包覆納米普魯士藍的制備及電化學分析應用

王海寧，齊 譽，孫 昭，馮濤濤，洪成林

(石河子大學 化學化工學院 新疆兵團材料化工工程技術研究中心，新疆維吾爾自治區教育廳高校材料化工重點實驗室，新疆 石河子 832003)

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酶功能化聚多巴胺包覆納米普魯士藍的制備及電化學分析應用

王海寧，齊 譽*，孫 昭，馮濤濤，洪成林*

(石河子大學 化學化工學院 新疆兵團材料化工工程技術研究中心，新疆維吾爾自治區教育廳高校材料化工重點實驗室，新疆 石河子 832003)

在納米金表面原位沉積普魯士藍，然后在核殼結構納米金-普魯士藍的表面包覆一層易氧化聚合的多巴胺保護膜，利用多巴胺聚合表面殘留的大量氨基和羥基進一步將納米鉑粒子修飾于聚多巴胺膜表面制得普魯士藍-聚多巴胺-納米鉑多層納米復合材料。將此復合材料修飾于金電極表面，協同使用辣根過氧化物酶用于H2O2濃度的檢測。結果表明：聚多巴胺的引入有效增加了普魯士藍的穩定性，增大了納米鉑的負載量以及辣根過氧化物酶的生物活性；由于普魯士藍、納米鉑和辣根過氧化物酶的多重信號放大作用，酶功能化納米復合材料修飾電極對H2O2表現出良好的電還原活性。優化條件下，對H2O2的檢測范圍為2.0×10-7～1.0×10-3mol·L-1，檢出限(S/N=3)為1.2×10-7mol·L-1。

過氧化氫傳感器；納米復合材料；普魯士藍；聚多巴胺；辣根過氧化物酶

新型納米復合材料由于具有較大的比表面積，較高的表面反應活性和催化效率等特性[1-2]而被越來越多地應用于催化和電催化研究[3-4]。納米材料具有良好的生物相容性，酶功能化的納米復合材料具有特異性和高效的催化活性，因此其在電化學分析方面有著極大的應用前景[5-6]。酶或酶功能化的納米電活性材料修飾于電極表面后其穩定性和電催化活性的保持已經成為當前研究的熱點之一[7-8]。

研究表明，納米普魯士藍(PB)具有優良的電化學氧化還原活性，且對H2O2具有極強的催化活性，被譽為“人工過氧化物酶”[9-10]。然而，立方體結構的PB容易流失，不易進一步修飾，且pH值適應范圍窄，使其應用受到很大限制。多巴胺(DA)具有良好的氧化自聚合能力和優良的生物相容性[11-13]，能夠阻止PB的流失并增大其pH值適應范圍，DA聚合成膜后表面殘留有大量的羥基和氨基[14]，可與納米鉑粒子(Pt NPs)結合。Pt NPs不僅具有較大的比表面積和優良的生物相容性，而且其對H2O2也有著獨特的催化活性[15-16]。

本文首先在納米金表面原位沉積PB，然后利用DA易氧化自聚合的特性，在核殼結構Au-PB的表面包覆一層聚多巴胺(PDA)保護膜，有效增強了PB的穩定性和pH值適應范圍。利用DA聚合表面殘留的大量氨基和羥基進一步將Pt NPs修飾于PDA表面制得Au-PB-PDA-Pt多層納米復合材料，并對辣根過氧化物酶(HRP)功能化的Au-PB-PDA-Pt復合材料的電化學性能進行了探究。由于PB，Pt NPs和HRP對H2O2的協同催化作用，該復合材料修飾電極對H2O2表現出良好的電還原活性。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

三氯化鐵(FeCl3·6H2O)、二氯化鐵(FeCl2·4H2O)、鐵氰化鉀(K4[Fe(CN)6]·3H2O)、硼氫化鈉、多巴胺(DA)、氯金酸(HAuCl4)、氯鉑酸(H2PtCl6·6H2O)購于Alfa Aesar公司;辣根過氧化物酶(HRP)購于上海江萊生物科技有限公司；其它試劑均為分析純試劑，購于成都市科隆化學品有限公司；實驗用水為超純水。

Spectrumlab-54型紫外可見分光光度計(UV-Vis，上海譜元儀器有限公司)；Hitachi H-600型透射電鏡(TEM，日本日立公司)；D8 Advance型X射線衍射儀(XRD，德國布魯克公司)。化學實驗采用三電極系統：工作電極為金電極(天津艾達科技發展有限公司，直徑4.0 mm)，對電極為鉑絲電極，參比電極為飽和甘汞電極(SCE)；循環伏安法(CV)、電流-時間法和電化學交流阻抗譜(EIS)測定均在Potentiostat/Galvanostat Model 283 型電化學綜合分析儀(美國阿美特克有限公司)上完成。

1.2 Au-PB-PDA-Pt納米復合材料的制備

Au NPs溶膠的制備：取0.6 mL 1%氯金酸水溶液分別加入40 mL預冷(4 ℃)的水和0.2 mL 0.2 mol ·L-1K2CO3溶液，在攪拌下加入適量新鮮配制的0.5 mg·mL-1NaBH4溶液，持續攪拌至溶液由藍紫色變為橙紅色止，即制得Au NPs溶膠。

Au-PB的制備：配制10 mL含有0.05 mol·L-1K3[Fe(CN)6]和10 mmol·L-1HCl的混合溶液，將其緩慢加入10 mL Au NPs溶膠中，持續超聲形成均一的混合溶液。再將2 mL 0.05 mol·L-1FeCl3溶液緩慢滴加至上述混合溶液中，并加入過量的H2O2溶液。室溫下超聲反應1 h后離心分離，用超純水洗至中性，定容至10 mL，于4 ℃冰箱保存備用。

Au-PB-PDA的制備：取0.5 mL Au-PB懸濁液超聲10 min，加入40 mL含有60 mg多巴胺的pH 6.5 PBS溶液。在冰水浴中快速攪拌8 h以使多巴胺聚合在Au-PB納米粒子表面。離心分離后，用水洗至中性，定容至5 mL，于4 ℃冰箱保存備用。

Au-PB-PDA-Pt的制備：采用硼氫化鈉還原氯鉑酸制備Pt NPs。將4 mL質量分數為0.1%的氯鉑酸水溶液在攪拌下緩慢滴加0.5 mL新鮮配制的0.1 mol·L-1NaBH4溶液，強攪拌反應30 min后10 000 r/min離心分離，定容至4 mL得Pt NPs溶膠。將5 mL制備好的Au-PB-PDA溶液超聲10 min后，加入2 mL Pt NPs溶膠再次超聲10 min，離心分離后定容至2 mL得Au-PB-PDA-Pt溶膠，于4 ℃冰箱保存備用。Au-PB-PDA-Pt的制備流程如圖1A所示。

本實驗還制備了Au-PB-Pt和Au-PDA-Pt兩種納米復合材料以對比電化學性能差異。

Au-PB-Pt的制備：取4 mL質量分數為0.1%的氯鉑酸水溶液，攪拌下緩慢滴加0.5 mL新鮮配制的0.1 mol·L-1NaBH4溶液，強攪拌反應30 min后10 000 r/min離心分離，定容至4 mL得Pt NPs溶膠。將5 mL制備好的Au-PB溶液超聲10 min后，加入2 mL Pt NPs溶膠再次超聲10 min，離心分離后定容至2 mL得Au-PB-Pt溶膠，于4 ℃冰箱保存備用。

Au-PDA-Pt的制備：取0.5 mL制備的Au溶膠，加入至40 mL含有60 mg多巴胺的pH 6.5 PBS溶液中。在冰水浴中快速攪拌8 h以使多巴胺聚合在Au NPs表面。離心分離，用超純水洗至中性，定容至5 mL。將5 mL制備好的Au-PDA溶液超聲10 min后，加入2 mL Pt NPs溶膠再次超聲10 min，離心分離后定容至2 mL得Au-PDA-Pt溶膠，于4 ℃冰箱保存備用。

圖1 Au-PB-PDA-Pt(A)和修飾電極(B)的制備過程Fig.1 Procedures for the fabrication of Au-PB-PDA-Pt nanocomposites(A) and the modified electrode(B)

1.3 修飾電極的制備

將金電極(GE，Φ=4 mm)分別用0.3 μm和0.05 μm的Al2O3粉末拋光成鏡面后，放入Piranha溶液(H2O2與H2SO4體積比為3∶7)中浸泡10 min，再依次用無水乙醇和水超聲清洗2 min[17-20]。取15 μL預先充分超聲分散的Au-PB-PDA-Pt溶膠滴在處理好的GE表面，于4 ℃冰箱放置晾干，水洗后移取15 μL 5 mg·mL-1的HRP溶液滴涂于修飾電極表面，放置在盛有少量水的燒杯上方于4 ℃冰箱吸附6 h。將電極取出后用水從電極側面沖洗掉表面的物理吸附粒子，得到GE/Au-PB-PDA-Pt/HRP，其制備過程如圖1B所示。本實驗所用的其它納米粒子修飾電極均與GE/Au-PB-PDA-Pt/HRP的制備方法相同。

圖2 不同納米復合材料的紫外可見光譜圖Fig.2 UV-Vis spectra of different nanocompositesa：Au；b:PB；c：Au-PB；d:Au&PB；e：Au-PB-PDA

2 結果與討論

2.1 納米復合材料的表征

2.1.1 納米復合材料的UV-Vis表征 采用紫外可見光譜對復合材料制備過程中不同階段的納米材料進行分析，結果見圖2。圖2a在530 nm處出現了Au NPs的特征吸收峰，圖2b在700 nm處出現了PB的特征吸收峰，且無其他雜峰，表明實驗制備出較純的Au NPs和PB。Au-PB納米顆粒的紫外可見光譜(圖2c)只在700 nm處觀察到PB的特征吸收峰，作為對照Au NPs和PB混合溶膠的紫外可見光譜圖(圖2d)分別顯示出Au NPs和PB的特征吸收峰，說明實驗得到的Au-PB并非二者簡單的混合物，可能是核殼型的Au-PB納米顆粒。圖2e在280 nm處出現了PDA的特征吸收峰，證明制備的Au-PB-PDA材料中PDA的存在。

圖3 納米復合材料的TEM表征圖Fig.3 TEM images of different nanocompositesA：Au；B：Au-PB；C：Au-PB-PDA；D：Au-PB-PDA-Pt

2.1.2 納米復合材料的TEM表征 圖3為納米復合材料制備過程的透射電鏡表征圖。由圖3A可以看出所制備的納米金粒徑分布在5～8 nm。所制備的Au-PB粒徑則明顯增大，達到70 nm左右，且主要為球形(圖3B)，說明PB成功包裹在Au NPs的表面。Au-PB進一步包覆上PDA膜后，形貌有所改變，PDA膜清晰可見(圖3C)。由圖3D可以看出Au-PB-PDA表面已負載上一定量的Pt NPs，表明已成功制備了Au-PB-PDA-Pt納米復合材料。

圖4 Au-PB(a)與Au-PB-PDA-Pt(b)的 XRD 表征圖Fig.4 XRD patterns of Au-PB(a) and Au-PB-PDA-Pt(b)

圖5 不同納米材料修飾電極的循環伏安圖Fig.5 CV curves of different electrodes insert：EIS curves of different electrodes;0.1 mol/L PBS buffer(pH 6.5)；a：bare GE;b：GE/Au-PB-PDA;c：GE/Au-PB-PDA-Pt;d：GE/Au-PB-PDA-Pt/HRP

2.1.3 納米復合材料的 XRD 表征 圖4為納米復合材料的XRD表征結果。其中，圖 4a為 Au-PB復合材料的XRD圖，PB在 2θ為 17.54°，24.74°，35.52°和39.61°處出現了特征衍射峰，對應PB晶面為(200)，(220)，(400) 和(420)；未出現明顯的Au NPs特征峰，可能是由于Au NPs的量相對較少，被較強的PB特征峰掩蓋。圖4B為 Au-PB-PDA-Pt的XRD圖，除了PB的特征衍射峰外，新出現了 2θ為 46.29°,67.47°,81.36°和85.72°的衍射峰，同時2θ=39.61°處的衍射峰明顯增強，分別對應于Pt NPs的(200),(311),(222) 和(111)晶面，表明Pt NPs已在Au-PB-PDA復合物表面成功負載。

2.2 修飾電極的電化學行為

2.2.1 不同納米材料修飾電極的CV表征 圖5為納米材料修飾電極過程的循環伏安表征。由圖可見，裸金電極表面無電活性材料，故未觀察到氧化還原峰(圖5a)；而GE/Au-PB-PDA的CV曲線在PBS緩沖溶液中出現1對明顯的氧化還原峰(圖5b)，其原因是修飾在金電極表面的Au-PB-PDA含有電化學活性物質PB和導電性能優良的Au NPs；GE/Au-PB-PDA-Pt產生的氧化還原峰電流進一步增大(圖5c)，這也是由于Pt NPs良好的導電性能及其較大的比表面積提高了復合材料的性能；而當HRP被固載在電極表面后，HRP阻礙了電子在電極表面的傳遞，致使峰電流有所降低(圖5d)。

2.2.2 不同納米材料修飾電極的EIS表征 進一步考察了不同納米材料修飾電極的電化學交流阻抗譜圖(圖5插圖)。結果顯示，裸金電極表現出非常小的交流阻抗，當被修飾上Au-PB-PDA之后，雖然有Au NPs的存在，但PDA較弱的導電性能依然使電極的阻抗出現較大增加。加入了Pt NPs的復合材料Au-PB-PDA-Pt修飾于電極表面之后，由于Pt NPs較大的比表面積與良好的電子傳遞性能使得交流阻抗值有所降低。HRP修飾于電極表面后由于其較弱的導電性能使得交流阻抗進一步增大。這與納米材料修飾電極的CV表征結果一致。

圖6 不同修飾電極對H2O2的循環伏安圖Fig.6 CV curves of different electrodes in 0.1 mol ·L-1pH 6.5 PBS with 0.1 mmol·L-1 H2O2a：GE/ Au-PB;b：GE/Au-PB-Pt;c：GE/Au-PB-PDA-Pt;d：GE/Au-PB-PDA-Pt/HRP

圖7 GE/Au-PB-PDA-Pt/HRP修飾電極對H2O2的I～t響應曲線Fig.7 Chronoamperometric response to H2O2additions on GE/Au-PB-PDA-Pt/HRP

2.2.3 不同修飾電極對H2O2的CV響應 考察了不同修飾電極對H2O2的CV響應(圖6)。圖6a為GE/Au-PB在含有0.1 mmol·L-1H2O2的pH 6.5 PBS溶液中的CV曲線。在GE/Au-PB電極中引入對H2O2具有強催化性能的Pt NPs后表現出更強的催化活性(圖6b)。在電極中進一步引入聚多巴胺(GE/Au-PB-PDA-Pt)后，增大了Pt NPs的分散性與負載量，同時增強了PB的穩定性，因此表現出更強的催化活性(圖6c)。而具有生物催化活性的HRP的使用使還原峰電流進一步增大(圖6d)，表明該修飾電極對H2O2的催化還原能力得到了進一步增強。

2.2.4 pH值對電極性能的影響 檢測液的pH值是影響生物酶分子HRP活性和電子媒介體PB穩定性的重要因素。因此，考察了GE/Au-PB-PDA-Pt/HRP在 pH 4.0～9.0范圍內 PBS 緩沖液中的CV響應情況。結果顯示，還原峰電流隨著pH值的增加而增大，pH 6.0時峰電流達到最大值，此后還原峰電流隨著pH值的增加而降低，故選擇pH 6.0的PBS為傳感器的檢測底液。

2.2.5 工作電位對響應電流的影響 在-0.45～0.05 V范圍內，考察了工作電位對修飾電極性能的影響，繪制了不同電位下傳感器在每次加入0.1 mmol·L-1H2O2的I～t曲線。不同工作電位下對應的標準曲線以及標準曲線斜率與其對應電位的折線圖顯示，工作電位在-0.35 V時修飾電極表現出最大的靈敏度。因此實驗選擇工作電位為-0.35 V。

2.2.6 不同修飾電極對H2O2電催化活性的比較 比較了GE/ Au-PDA-Pt，GE/ Au-PB-PDA，GE/Au-PB-PDA-Pt和GE/Au-PB-PDA-Pt/HRP對 H2O2的I～t響應曲線。結果表明，PB NPs和Pt NPs對H2O2均有一定的電催化活性，兩者的協同作用表現出更強的催化活性，傳感器靈敏度有了很大的提高，而HRP作為一種具有高催化活性的生物酶，其應用進一步提高了傳感器的靈敏度。

2.2.7I～t法檢測H2O2濃度 在最佳檢測條件下，考察了傳感器對H2O2的檢測性能。由圖7可見，傳感器對H2O2的線性回歸方程為I=7.753+32 913cH2O2，r2=0.998 0 。線性范圍為2.0×10-7～1.0×10-3mol ·L-1，檢出限(S/N=3)為1.2×10-7mol·L-1。該傳感器性能優良，這主要得益于PB NPs優良的電化學活性，PDA良好的生物相容性和對Pt NPs良好的分散吸附性能；而Pt NPs的引入不僅增強了修飾電極表面的電子傳導能力，還極大提高了對H2O2的催化活性。由于PB,Pt NPs和HRP對H2O2的協同催化作用，該復合材料構建的H2O2傳感器具有更高的靈敏度。

3 結 論

本文成功制備了Au-PB-PDA-Pt多層納米復合材料，并將HRP功能化的Au-PB-PDA-Pt修飾電極用于H2O2濃度的檢測。實驗發現，PDA的引入有效增加了PB的穩定性、Pt NPs的負載量和后續HRP的生物活性；由于PB,Pt NPs和HRP對H2O2的協同催化作用，酶功能化納米復合材料修飾電極對H2O2表現出良好的電還原活性。該H2O2傳感器成本低廉，所使用的納米復合材料制備過程簡便，有望應用于生物體中H2O2的分析檢測。

[2] Rawal R，Chawla S，Pundir C S.Biosens.Bioelectron.，2012，31(1):144-150.

[3] Kleijn S E F，Lai S C S，Koper P T M，Unwin P R.Angew.Chem.Int.Ed.，2014，53(1):3558-3586.

[4] Ka?ar C，Dalkiran B，Erden P E，Kili? E.Appl.Surf.Sci.，2014，311(9):139-146.

[5] Abdollah S，Layla M，Rahman H.Talanta，2008，75(1):147-156.

[7] Liang W，Yi W S.Clin.Biochem.，2009，42(15):1524-1530.

[8] Kumar D R，Manoj D，Santhanalakshmi J.Sens.ActuatorsB，2013，188(11):603-612.

[9] Yao Y，Bai X，Shiu K K.Nanomaterials，2012，2(4):428-444.

[10] Zhai C，Sun X，Zhao W，Gong Z，Wang X.Biosens.Bioelectron.，2013，42:124-130.

[11] Hong S，Kim K Y，Wook H J，Park S Y，Lee K D，Lee D Y，Lee H.Nanomedicine，2011，6(5):793-801.

[12] Lee H，Dellatore S M，Miller W M，Messersmith P B.Science，2007，318(5849):426-430.

[13] Lee H，Rho J，Messersmith P B.Adv.Mater.，2009，21(4):431-434.

[14] Hong S，Na Y S，Choi S，Song I T，Kim W Y，Lee H.Adv.Funct.Mater.，2012，22(22):4711-4717.

[15] Lin M，Huang H，Liu Y，Liang C，Fei S，Chen X，Ni C.Nanotechnology，2013，24(6):065501-065509.

[16] Yan L，Bo X，Zhu D，Guo L.Talanta，2014，120:304-311.

[17] Li N，Yuan R，Chai Y Q，Chen S H，Tang D P，An H Z.J.Instrum.Anal.(李娜，袁若，柴雅琴，陳時洪，唐點平，安海珍.分析測試學報)，2007，26(6):769-773.

[18] Hong C，Yuan R，Chai Y，Zhuo Y.Electroanalysis，2008，20(20):2185-2191.

[19] Li Z G，Dai J Y，Shi Y Q，Bi S P.J.Instrum.Anal.(李志果，戴建遠，史艷青，畢樹平.分析測試學報)，2012，31(9):1170-1177.

[20] Zhu Y P，Yuan R，Chai Y Q，Qin S，Yuan Y L.Chin.J.Anal.Chem.(朱宇萍，袁若，柴雅琴，覃松，袁亞利.分析化學)，2012，40(3):359-364.

Preparation and Electrochemical Analysis Application of Enzyme-functionalized Prussia Blue-Polydopamine-Platinum Nanocomposites

WANG Hai-ning，QI Yu*,SUN Zhao，FENG Tao-tao，HONG Cheng-lin*

( Key Laboratory of Materials-Oriented Chemical Engineering of Xinjiang Uygur Autonomous Region，Engineering Research Center of Materials-Oriented Chemical Engineering of Xinjiang Bingtuan，School of Chemistry and Chemical Engineering，Shihezi University，Shihezi 832003，China)

In this paper，prussian blue(PB) coated gold nanoparticles(Au NPs) were firstly prepared by in situ method.Then，polydopamine(PDA) wrapped Au-PB was synthesized based on the characteristic of one-step oxidative polymerization of dopamine.The bioinspired surface enriched amino and hydroxyl groups were further used as a support to anchor active platinum nanoparticles(Pt NPs).Horseradish peroxidase(HRP) functionalized Au-PB-PDA-Pt nanocomposites was also used for the fabrication of H2O2biosensor.By taking advantages of the excellent biocompatibility and film forming ability of PDA，the large surface area and high biocompatibility of Pt NPs，and the synergistic employ of PB，Pt and HRP，the HRP functionalized nanocomposites modified electrode exhibited an excellent electroreduction activity to H2O2.Under the optimum conditions，the linear detection range from 2.0×10-7-1.0×10-3mol·L-1was observed,and a detection limit was 1.2×10-7mol·L-1.

H2O2sensor;nanocomposites;prussia blue;polydopamine;horseradish peroxidase

2016-04-02；

2016-05-09

國家自然科學基金資助項目(21065009)；教育部重點資助項目(210251)；兵團重點領域創新團隊計劃(2015BD003)

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.10.012

O657.1；O625.524

A

1004-4957(2016)10-1289-06

*通訊作者：洪成林，教授，研究方向：納米材料和電化學分析，Tel：0993-2057270，E-mail：hcl_tea@shzu.edu.cn

齊 譽，研究方向：有機及電化學分析，Tel：0993-2057270，E-mail：qy_01tea@shzu.edu.cn