植物蛋白質N-糖基化修飾研究進展*

葉 強,金曉琴,劉偉娜,韓鳳琴,康 振,楊 莉

(浙江師范大學 化學與生命科學學院,浙江 金華 321004)

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植物蛋白質N-糖基化修飾研究進展*

葉 強,金曉琴,劉偉娜,韓鳳琴,康 振,楊 莉

(浙江師范大學 化學與生命科學學院,浙江 金華 321004)

N-糖基化與植物蛋白質正確折疊、細胞凋亡、器官發育及信號轉導等生物學功能密切相關.主要對植物蛋白N-糖基化的結構、生物合成、加工修飾、相關酶生物學功能，以及糖蛋白的分離鑒定方法等進行了綜述,并探討了植物糖基化蛋白功能研究的應用前景及存在的問題.

植物蛋白質；N-糖基化修飾；糖苷合成；生物學功能

真核生物細胞內的多肽及蛋白質分子經核糖體合成后大多需翻譯后修飾,如泛素化、磷酰化、糖基化等,確保蛋白質正常行使其生物學功能[1].其中,糖基化是真核生物體內常見的蛋白翻譯后修飾,糖蛋白占細胞蛋白質的50%以上,參與細胞識別、分化、發育、信號轉導和免疫應答等多個重要的生命過程[2-3].

蛋白質的糖基化修飾是指糖鏈與蛋白質上特定氨基酸殘基共價結合的過程.根據連接方式,主要分為N-糖基化、O-糖基化、C-糖基化及糖基磷脂酰肌醇錨定連接4種類型[3-5].N-糖基化是指內質網(endoplasmic reticulum,ER)上糖基轉移酶催化轉移至新生肽Asn-X-Ser/Thr(X是除脯氨酸Pro外的任一氨基酸；Asn為天冬酰胺；Ser為絲氨酸；Thr為蘇氨酸)基序的Asn殘基,是蛋白質糖基化修飾的重要形式,胞外分泌蛋白、膜整合蛋白及構成內膜系統的可溶性駐留蛋白大多經N-糖基化修飾.酵母、哺乳動物和細菌中相關糖蛋白的鑒定為植物N-糖基化蛋白功能分析奠定了基礎，但植物蛋白N-糖基化研究尚處于起步階段.蛋白質的N-糖基化主要包括糖鏈的生物合成、糖鏈的轉移及糖鏈的進一步加工.本文主要從植物蛋白的N-糖鏈結構、N-糖基化過程及其生物學功能等方面進行了綜述.

1 植物蛋白N-糖鏈的基本結構

植物N-糖蛋白的糖鏈包含1個核心五糖,根據其結構可分為4種類型(見圖1)：1)寡甘露糖型：最簡單的N-糖鏈,僅含核心五糖結構；2)高甘露糖型：具有5個及以上的甘露糖(mannose,Man)殘基；3)復雜型：糖鏈除含3個Man核心及與Man連接的N-乙酰葡糖胺糖基(GlcNAc)外,還包含唾液酸及其衍生物；4)雜合型：具有復雜型和高甘露糖型2類糖鏈結構元件[6-7].

(a)寡甘露糖型；(b)高甘露糖型；(c)復雜型；(d)雜合型.虛框內為N-糖鏈核心結構圖1 植物糖蛋白N-糖鏈的4種基本結構

圖2 脂連寡糖(LLO)的生物合成

2 植物蛋白質的N-糖基化修飾

蛋白質的N-糖基化修飾主要包括糖鏈的生物合成、糖鏈轉移至新合成蛋白，以及蛋白糖鏈的進一步加工.

2.1N-糖鏈的生物合成

蛋白質的N-糖基化修飾主要發生于內質網(ER)和高爾基體(Golgi)上,糖鏈與肽鏈的生物合成同步進行,動物與植物N-糖鏈的生物合成基本一致[8].糖鏈與新生肽結合前以脂連寡糖(lipid-linked oligosaccharide,LLO)形式存在[9-10],LLO的生物合成主要包括4個步驟(見圖2)：1)面向胞質一側的ER膜上,2分子GlcNAc經GlcNAc-1-磷酸轉移酶(GlcNAc-1-P transferase,GPT,如ALG7與ALG13/14)催化與二磷酸-多萜醇(Dol-PP)結合生成GlcNAc2-PP-Dol；2)5分子Man在糖基轉移酶(glycosyltransferase,GT,如ALG1,ALG2與ALG11)作用下依次與GlcNAc結合,生成具有2個分枝的核心五糖；3)核心五糖經翻轉酶催化進入ER內腔；4)在ER內腔,核心五糖經特定GT(ALG3,ALG6,ALG8-ALG10及ALG12)催化添加4分子Man及3分子葡萄糖(glucose,Glc),生成包含14個糖基的LLO前體[3-4,11].在進入ER腔前,LLO糖鏈合成時糖基供體為鳥嘌呤核苷二磷酸(UDP)-甘露糖與尿嘧啶核苷二磷酸(GDP)-N-乙酰葡糖胺；LLO翻轉進入ER內腔后,糖基供體則為多萜醇-葡萄糖與多萜醇-甘露糖.

2.2 蛋白質N-糖基化修飾

糖鏈LLO生物合成的同時,新合成的蛋白質也經易位子進入ER腔[3].LLO在寡聚糖轉移酶(oligosaccharyltransferase,OST)作用下轉移至新生肽Asn-X-Ser/Thr基序的Asn殘基[9-10].LLO轉移至新生肽后,新生肽上的LLO將繼續被修飾,主要包括以下2個過程：

1)鈣聯蛋白-鈣網蛋白(calnexin-calreticulin cycle,CNX-CRT)循環

如圖3所示：轉移至新合成蛋白的LLO分別經α-葡糖苷酶Ⅰ(α-glucosidase Ⅰ,GCSⅠ/GI)與α-葡糖苷酶Ⅱ(GCSⅡ/GⅡ)水解末端2個Glc殘基,生成的寡糖結構Glc1Man9GlcNAc2被CNX或(和)CRT識別并結合；糖鏈上最后一個Glc殘基經GCSⅡ水解后(結構為Man9GlcNAc2),糖蛋白脫離CNX-CRT循環,轉運至Golgi進一步修飾[12-14].若蛋白質未正確折疊,糖鏈會經UDP-Glc：糖蛋白糖基轉移酶(UDP-glucose:glycoprotein-glucosyltransferase,UGGT)再次糖基化,重新進入CNX-CRT循環,或者直接進入蛋白降解程序[15].

圖3 鈣聯蛋白-鈣網蛋白(CNX-CRT)循環

2)蛋白糖鏈在Golgi上的再加工

糖蛋白在ER完成修飾后,通過COPⅡ型膜泡運輸至Golgi再加工[6,11].首先,Man9GlcNAc2或Man8GlcNAc2經α-甘露糖苷酶Ⅰ(Golgi-α-ManⅠ,MNS1/2)水解糖鏈上3～4分子Man殘基；接著,N-乙酰氨基葡萄糖轉移酶Ⅰ(glucosamine-phosphateN-acetyltransferase Ⅰ,GlcNAcT或GnTI)催化向糖鏈添加1分子GlcNAc殘基,生成GlcNAcMan5GlcNAc2(見圖4)；最后,在XylT,FucT和GalT等酶的作用下加工生成復雜型或雜合型糖鏈[16-17].

圖4 復雜型N-糖鏈在高爾基體上的再加工

3 蛋白質N-糖基化修飾的相關酶及其生物學功能

3.1 蛋白質N-糖基化修飾相關酶

植物中蛋白質保守的N-糖基化修飾進程主要是由糖基轉移酶(glycosyltransferase,GT)、α-葡糖苷酶(α-glucosidase,GCS)及甘露糖苷酶(mannosidase,MNS)完成.

1)GT：主要負責LLO的生物合成.根據糖基供體,GT可分為Leloir與non-Leloir 2種類型.Leloir型GT以糖核苷酸GDP-Man及UDP-GlcNAc為糖基供體,LLO從胞質一側翻轉至ER內腔前所涉及的糖基轉移酶多為該類型[18].non-Leloir型GT則以磷酸酯連接的糖Dol-Glc與Dol-Man為糖基供體[19].

2)GCS：在CNX-CRT循環中起重要作用的是GCSⅠ與GCSⅡ.GCSⅠ與OST復合物緊密相連,為Ⅱ型膜蛋白,水解LLO末端第一個Glc殘基[15].GCSⅡ由α亞基(功能域)與β亞基(定位域)構成,在N-糖苷合成早期敲除α亞基后糖鏈末端多出1～2個Glc,N-糖鏈不能進行后續修飾[14,20].目前尚未發現能夠替代GCSⅡ功能的酶.

3)MNS：由ER型(α-ManⅠ,MNS3)及Golgi型(α-ManⅠ,MNS1/2)組成,負責去除糖鏈上的Man殘基(見圖4).糖蛋白離開CNX-CRT循環后,其糖鏈可被MNS3水解生成Man8GlcNAc2,再進入Golgi；也可不經水解,直接進入Golgi[21-22].MNS1-3與ER執行錯誤折疊糖蛋白降解(endoplastic reticulum-associated degradation machinery,ERAD)途徑密切相關,但具體機制尚未明確[17,23].

3.2 蛋白質N-糖基化修飾在植物中的生物學功能

真核生物蛋白質的N-糖苷具有幫助蛋白質正確折疊、輔助蛋白質功能發揮、抑制或延緩蛋白質降解等作用[7].

1)N-糖苷幫助蛋白質正確折疊.

蛋白質的N-糖基化修飾過程中,CNX-CRT能夠專一識別糖蛋白上的GlcMan9GlcNAc2結構[14],與未折疊糖蛋白結合,避免折疊中間體及錯誤折疊蛋白從ER逃逸[22,24-25].錯誤折疊且無法修復的糖蛋白進入ERAD途徑,由ERAD復合物運輸至胞質溶膠,經糖基肽酶水解去除糖鏈后,蛋白進入26S蛋白酶體降解[15,26-27].

2)N-糖基化修飾蛋白與細胞凋亡密切相關.

錯誤折疊的糖蛋白滯留于ER,激發未折疊蛋白應答反應(unfold protein response,UPR).Iwata等[28]發現衣霉素(Tunicamycin,GT抑制劑)能夠誘導煙草懸浮細胞產生UPR反應.DAD1(OST復合物亞基之一)作為抗細胞凋亡因子,缺失引起DGL1(OST復合物亞基之一)快速降解,引發細胞凋亡；超表達則保護原生質體免受紫外線引起的DNA斷裂和細胞損傷[29-31].

3)N-糖基化修飾蛋白影響細胞壁的組成與含量.

植物細胞壁主要由纖維素、半纖維素、果膠質等多糖組成.N-糖基化受阻時,植物細胞壁成分與含量將發生改變.例如：DGL1能夠影響細胞壁多糖的形成[32-34]；突變體gcs1與rsw3的細胞壁纖維素含量顯著降低[35]；Mns1-3也觀察到細胞壁不均勻等現象[36].

4)N-糖基化修飾蛋白對根發育的影響.

VTC1編碼GDP-Man焦磷酸化酶,合成GDP-Man,VTC1缺失會引起根生長的不可逆抑制[37].文獻[38]發現擬南芥突變體cgl1對鹽脅迫敏感,根生長受抑制,根尖形態發生異常.此外,SWP1(OST復合物亞基之一)突變體將抑制側根發生與伸長[39]；Osdgl1的根細胞體積變小,部分根細胞死亡[40]；AtMns1-3也觀察到根變短的現象[21,36].

5)N-糖苷對果實發育的影響.

在果實的成熟過程中,N-聚糖大量積累,因此，N-糖基化也能夠影響植物果實的發育.大量的實驗證明,N-聚糖的增加能夠促進果實轉色并引起乙烯含量的增加,而對N-糖基化修飾過程進行抑制后果實延遲成熟.例如，對β-D-乙酰氨基己糖苷酶的酶活進行抑制能夠延長果實的貨架期[41-43].

此外,蛋白質的N-糖基化修飾在細胞分化、免疫、信號轉導及激素調控等多個重要的生命進程都起到十分重要的作用[44-45].

4 N-糖蛋白的富集分離和鑒定方法

目前，有關植物蛋白的N-糖基化修飾研究較少,對于植物特定發育時期哪些糖蛋白發生N-糖基化修飾及N-糖基化位點等仍然知之甚少.植物體內糖蛋白上糖鏈的合成與修飾十分復雜,無固定模板與結構,且N-糖基化修飾的蛋白豐度遠遠低于未經N-糖基化修飾的蛋白.因此，富集分離N-糖苷、N-糖肽與N-糖蛋白十分困難[46-47].

近年來，隨著蛋白質組學的飛速發展,應用蛋白質組學全面分析植物N-糖蛋白質,大大加快了糖蛋白質組的研究.目前最常用的N-糖蛋白組研究主要包括富集分離、酶解消化和鑒定3個步驟：首先應用刀豆蛋白A凝集素[47]、麥胚凝集素[48]及小扁豆凝集素[49]等凝集素與N-糖鏈特有的結構共價結合,將N-糖蛋白從眾多蛋白中分離出來；分離出的糖蛋白再經PNGase F等糖苷酶處理,N-糖肽與N-糖鏈相連處由天冬酰胺轉化為天冬氨酸,N-糖肽分子量發生改變,再采用質譜技術分析N-糖肽序列及N-糖蛋白的糖基化位點.文獻[50]采用刀豆蛋白A凝集素層析結合二維液相色譜富集分離糖蛋白,經胰蛋白酶消化后進行液相色譜串聯基質輔助激光解吸附質譜技術(LC-MALDI-MS/MS)分析,共鑒定出133個糖蛋白,并預測了其中大部分糖蛋白的糖基化位點.文獻[51]采用類似方法，從二穗短柄草中鑒定出46個N-糖蛋白,以及47個糖基化位點.此外,Silva-Sanchez等[52]應用糖蛋白特異熒光染料 ProQ 染色2D蛋白膠,從玉米胚乳己糖缺失突變體mn1及野生型中分離出45個差異糖蛋白.

5 展 望

隨著糖生物學研究的迅速發展,糖蛋白已成為生物化學研究的熱點和前沿,在糖蛋白的結構、生物合成、代謝及其生理作用等方面已取得了不少的成果,但仍有很多糖蛋白的結構和功能未知.由于糖的合成無固定模板和糖結構與功能的不對應性,糖蛋白的鑒定、功能與開發利用研究相對困難,尤其是植物糖蛋白的研究落后于動物、酵母等的相關研究[25,45].

隨著多種植物基因組測序的完成,以及大量新技術、新方法及新軟件的開發利用,加速了植物中糖蛋白的分離及結構與生物學功能的鑒定.但是,一個蛋白質可能有幾十種甚至上百種不同的多聚糖修飾基團，而且蛋白糖基化修飾在細胞中豐度也較低,如何明確這些糖蛋白的生物學功能仍面臨巨大的挑戰.此外,糖蛋白藥物對人類健康的重要性已開始受到重視,已上市的醫藥蛋白中70%以上為糖蛋白[53-54].應用植物作為生物反應器大量生產藥用糖蛋白，將是今后的研究方向之一.為確保糖蛋白藥物的安全性、均一性和藥效,研究植物糖蛋白的糖基化結構與生物活性,優化蛋白糖基化修飾的方法與條件,對于開發利用植物生產藥用重組糖蛋白也是必不可少的.

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(責任編輯 薛 榮)

Research progress onN-glycosylation proteins in plants

YE Qiang,JIN Xiaoqin,LIU Weina,HAN Fengqin,KANG Zhen,YANG Li

(CollegeofChemistryandLifeSciences,ZhejiangNormalUniversity,Jinhua321004,China)

N-glycosylation was closely related to correctly folded proteins,apoptosis,organ developments and signal transductions.It was reviewed the structures,biosynthesis,modifications and functions ofN-glycosylation,methods for isolation and identification of glycoprotein in plants.The application perspectives and potential problems were also discussed.

plant proteins; glycosylation;N-glycan synthesis; biological functions

10.16218/j.issn.1001-5051.2016.01.015

??2015-04-20；

2015-05-18

浙江省自然科學基金資助項目(LY14C150001)；浙江省大學生新苗人才計劃項目(2104R404024)

葉 強(1992-),男,浙江金華人,碩士研究生.研究方向：生物化學與分子生物學.通信作者：楊 莉.E-mail:yangli@zjnu.cn

Q51

A

1001-5051(2016)01-080-07