影響人血白蛋白Fv過濾時間的工藝研究

何勇，楊帆，夏潤，丁洪波，趙云

(1.四川大學，四川成都610065；2.成都蓉生藥業有限責任公司，四川成都610041）

影響人血白蛋白Fv過濾時間的工藝研究

何勇1，2，楊帆2，夏潤2，丁洪波2，趙云1★

(1.四川大學，四川成都610065；2.成都蓉生藥業有限責任公司，四川成都610041）

在利用壓濾技術分離Fv時，時常會出現過濾時間長，Fv沉淀中液體含量高及沉淀凍存到溫時間長的情況。經研究發現，上述情況主要受Fv制作時緩沖液添加速度及過濾時壓濾機進液壓強的影響。在其他工藝參數不變的情況下，改變緩沖液加液速度及進液壓強。經多批次生產統計發現，在平均加液速度為36L/h及進液壓強為160kPa時，能大幅縮短過濾時長，減少沉淀中液體含量，縮短沉淀凍存到溫時間。此工藝對縮短生產周期，降低能耗有重要意義。

人血白蛋白；Fv；加液速度；進液壓強；過濾時長

人血白蛋白是一種分子量小、表面積較大、具有高滲透壓的蛋白質，對治療失血性休克、嚴重燒傷、腦水腫、肝腎疾病血癥有重要作用。人血白蛋白是血液制品的主要產品，也是血漿蛋白生產工藝主線的最終產物。目前人血白蛋白的分離及純化應用最廣泛的是低溫乙醇法。多數血液制品生產企業采用改良的低溫乙醇工藝Cohn6/9法或N/K（Nitschmann-Kistlcr）法[1]，利用壓濾技術將固液分離得到人血白蛋白。壓濾分離為深層過濾，即過濾介質是具有一定厚度的濾板，其內部為迂回曲折的結構，過濾中多使用助濾劑，其粒間隙也構成了曲折的結構[2，3]。過濾液通過濾板時，主要通過機械阻擋的方式捕捉固體成分。在實際生產中，利用壓濾技術對制作完成的Fv進行過濾時，時常會出現過濾時間長，壓濾機過濾板壓高，吹干后濾餅中濾液多的情況，從而影響人血白蛋白中間體Fv沉淀的冷凍暫存及延長生產周期。通過研究發現，影響過濾壓力和過濾時長的原因主要與Fv制作時緩沖液的加液速度和過濾時壓濾機的進液壓有關。

1　主要材料與設備

1.1主要設備

壓濾機（FC.800.AC），購自EUROFILTEC公司；冰箱（MDF-U5412），購自SANYO公司；氣動隔膜泵（PX2），購自WILDEN公司；蠕動泵（L/S），購自MASTER FLEX公司。

1.2主要材料

50P濾板，美國PAll公司；助濾劑硅藻土，臨江益瑞石硅藻土有限公司；緩沖液，成都蓉生藥業有限責任公司；健康人血漿，成都蓉生藥業有限責任公司。

2　試驗方法

2.1制備人血白蛋白

制備人血白蛋白的低溫乙醇工藝如圖1。

圖1　白蛋白低溫乙醇工藝

2.2緩沖液加液速度的控制

用蠕動泵添加緩沖液至反應罐中，由流量計讀取加液速度，通過控制蠕動泵的轉速控制加液速度[4]。

2.3過濾進液壓強的控制

用氣動隔膜泵傳輸制品至壓濾機，由進液壓力表讀取進液壓強，氣動泵轉速越快，壓濾機進液壓越高。通過調節氣動泵轉速控制進液壓強[5]。

2.4過濾時間的檢測

從Fv過濾開始計時，至濾液過濾完壓濾機吹干結束為過濾時間。記錄在不同的加液速度和過濾進液壓下過濾所用的時間t（h）。

2.5沉淀凍存到溫時間檢測

在白蛋白生產過程中，常出現多批次的白蛋白中間體（Fv沉淀）用低溫冰箱暫存后再合并精制的情況。過濾所得到的Fv沉淀用醫用袋裝好后放入低溫冰箱，沉淀從-8℃凍存到-35℃所用時間即為沉淀凍存到溫時間。記錄不同的沉淀凍存到溫時間t（h）。

2.6沉淀中液體含量的測定

過濾所得Fv沉淀重量為M（g），沉淀溶解后用雙縮脲法測定蛋白濃度為C（g/L），溶解液體積V（L），由公式得出沉淀中液體含量（%）。

3　試驗結果

3.1加液速度的影響

在其他工藝參數一致情況下，固定進液壓強，以3個批次為同一組加液速度，統計在不同的加液速度下過濾時長，沉淀中液體含量及沉淀凍存到溫時間的情況，如圖2、3所示。

圖2　加液速度對過濾時長及沉淀中液體含量的影響

圖3　加液速度對沉淀凍存到溫時間的影響

由圖2、3得出，緩沖液的加液速度越快，制品過濾時間越短，沉淀中的液體含量低，沉淀凍存到溫時間越短。其主要原因是緩沖液加液速度越快，越有利于制品中的蛋白形成較大的聚集體，在過濾時越大的聚集體越容易被濾板及濾餅攔截，所以過濾速度越快，得到的沉淀中液體含量越少，沉淀凍存到溫時間越短。加液速度不能過快，由于緩沖液是由酸和乙醇混合而成，過快的加液速度會使添加的緩沖液不能及時的被分散導致局部蛋白變性。

3.2進液壓強的影響

在其他工藝參數一致情況下，固定緩沖液加液速度，以3個批次為同一組過濾進液壓強，統計在不同進液壓強下過濾時長，沉淀中液體含量及沉淀凍存到溫時間的情況，見圖4、5。

圖4　進液壓強對過濾時長及沉淀中液體含量的影響

圖5　進液壓強對沉淀凍存到溫的影響

由圖4、5得出，進液壓強過低或過高都會增加過濾時間。這主要是由于進液壓強由氣動隔膜泵控制，進液壓強越低則氣動隔膜泵的轉速慢，相應的過濾速度越慢；進液壓越高則氣動泵的轉速越快，相應的過濾速度越快。但50p濾板有其自身的過濾能力，過快的過濾速度會使制品堆積在濾板上，不利于疏松的濾餅形成，濾液不能順利穿過濾餅，使后期過濾難度增加，進而延長過濾時間。所以應選擇適中的進液壓強，即160Kpa的進液壓強。

3.3過濾時間

在其他參數一致的情況下，選擇緩沖液加液速度為36L/h，過濾進液壓強為160kPa，進行5個批次的平行驗證，得到的結果如表1。

表1　過濾時間對沉淀中濾液含量和凍存到溫時間的影響

過濾平均時間t=2.34h，過濾時間的標準差σ=0.024；沉淀中液體平均含量1.16%，沉淀中濾液含量標準差σ=0.024；沉淀凍存到溫平均時間t=18.2h，沉淀凍存到溫時間標準差σ=0.200。

4　討論

結果表明：在其他工藝參數一致的情況下，緩沖液加液速度越快，過濾時間越短；過低和過高的進液壓強都會延長過濾時間，只有在適中的進液壓強下，過濾時間才最短。添加緩沖液越快，越有利于形成大塊的聚合物；適中的進液壓強有利于形成疏松的濾餅。制品中大塊聚合物和疏松的濾餅更有利于過濾，在吹干壓濾機時，液體更容易穿過濾餅，形成的沉淀液體含量低，從而縮短沉淀凍存到溫時間。實驗表明，在一定的緩沖液添加速度和進液壓強下進行的平行驗證，Fv過濾時間短，Fv沉淀液體含量低，Fv沉淀凍存到溫時間短，且此工藝穩定性高，重現性好。

[1]浦奕奕．低溫乙醇法在人血白蛋白工業化生產中的應用[J].考試周刊,2008,2(3):236-237.

[2]譚邦青,曾學清.壓濾技術在低溫乙醇法制備人血白蛋白工藝中的應用[J].中國生化藥物雜志,2001,22(3):93-94.

[3]劉欣宴.人血白蛋白連續流壓濾工藝研究[D].山東,山東大學：26-30.

[4] Kobayashi K． Summary of recombinant human serum albumin development[J]. Biologicals,2006,34(1):55-59．

[5]楊曉波,王曉雷,王峰．人血白蛋白提取工藝的對比分析與改進方案[J].生命科學儀器,2010,8(2):44-48．

Process Research on the Filtration Time of Fv in Human Albumin

He Yong1,2,Yang Fan2,Xia Run2,Ding Hong-Bo2,Zhao Yun1*
(1.Sichuan University,Sichuan Chengdu 610065; 2.Chengdu Rongsheng Pharmaceutical Co. Ltd.,Sichuan Chengdu 610041)

During filtering Fv with pressure filtration technique,if the filter time is too long,Fv precipitations with high liquid content and the precipitations freeze-stored to the specified temperature with a long time happen frequently .The study found that those were influenced by the speed of adding buffer in manufacturing Fv and the liquid inlet pressure. In the case of other parameters constant,the speed of adding buffer and the liquid inlet pressure were changed. The statistics with multi-batch of production showed that it could reduce the filtration time,the liquid content of precipitations and the time of precipitations freeze-stored to the specified temperature with the speed of adding buffer 36.0L/h and the liquid inlet pressure 160kPa. It has an important significance to reduce production time and energy consumption.

Human Albumin; Fv; Speed of Adding Buffer; Feed Pressure; Filtration Time

TQ464

A

2096-0387（2016）05-0033-03

何勇（1987-），男，四川成都人，碩士研究生，研究方向：分子生物學及其生物技術。

趙云（1965-），四川成都人，博士，研究方向：油科植物的遺傳育種，分子生物學及其生物技術。