桑葉經霜前后總黃酮積累量與苯丙氨酸解氨酶活力及氣溫相關性分析

于小鳳，李韻竹，張魏琬麒，王篤軍，魏 淵，歐陽臻,*

（1.江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇 鎮江 212013；2.江蘇大學藥學院，江蘇 鎮江 212013；3.江蘇大學京江學院，江蘇 鎮江 212013）

桑葉經霜前后總黃酮積累量與苯丙氨酸解氨酶活力及氣溫相關性分析

于小鳳1,2，李韻竹3，張魏琬麒2，王篤軍2，魏 淵2，歐陽臻2,*

（1.江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇 鎮江 212013；2.江蘇大學藥學院，江蘇 鎮江 212013；3.江蘇大學京江學院，江蘇 鎮江 212013）

為研究經霜對桑葉總黃酮積累量影響的機制，分析桑葉經霜前后總黃酮積累量合成關鍵酶苯丙氨酸解氨酶（phenylalnine ammonialyase，PAL）活力的動態變化，并對總黃酮積累量及氣候溫度進行相關性分析。在6 mL pH 8.8、0.1 mol/L硼砂-鹽酸緩沖液中加入0.2 g桑葉葉片、0.2 g聚乙烯吡咯烷酮，底物L-苯丙氨酸濃度為0.04 mol/L，40 ℃條件下水浴反應40 min后測定經霜前后桑葉PAL活力，采用紫外分光光度法測定經霜前后桑葉總黃酮積累量。結果表明：PAL活力與平均氣溫呈極顯著負相關，與總黃酮積累量呈極顯著正相關，較低的溫度有利于黃酮類物質的積累。

桑葉；苯丙氨酸解氨酶；經霜；氣溫；總黃酮積累量

桑葉為桑科植物桑（Morus alba L.）的干燥葉，藥用歷史悠久；味苦、甘，性寒，歸肺、肝經，具有疏散風熱、清肺潤燥、清肝明目的功能，主要用于治療風熱感冒、肺熱燥咳、頭暈頭痛、目赤昏花等[1]。桑葉營養豐富，被我國衛生部列入“既是食品又是藥品”名單，在功能性食品領域研究開發中也具有廣闊前景[2]。中醫歷來認為霜桑葉具有上乘品質，古代眾多醫藥典籍中采用的桑葉也多為經霜后采收（霜桑葉），歷版《中國藥典》中收錄的桑葉藥材也為“霜桑葉”。本課題組前期研究發現經霜后桑葉中總黃酮積累量變高，同時發現氣候溫度與總黃酮積累量呈極顯著負相關[3]。總黃酮為桑葉主要活性成分之一[4-7]，具有消炎、抗菌作用。相關研究表明較低的溫度有利于黃酮類物質的積累，主要原因是低溫可以使總黃酮合成途徑中相關酶的活力提高[8-9]。苯丙氨酸解氨酶（phenylalnine ammonialyase，PAL）為生合成途徑參與黃酮類物質合成的第1個關鍵酶[10-13]。因此本課題組選取PAL關鍵酶，優選了桑葉中PAL活力測定條件，分析桑葉經霜前后PAL活力動態變化，并研究經霜前后PAL活力的變化與氣候溫度和總黃酮積累量之間的相關性，為闡明經霜對桑葉黃酮類活性成分影響的分子機制提供了一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桑葉：2015年4—12月采自江蘇大學桑樹種植園，取頂端幼葉1～3 片。經江蘇大學藥學院歐陽臻教授鑒定為桑科植物桑（Morus alba L.）的葉。鮮桑葉液氮速凍后放入-80 ℃超低溫冰箱中保存備用，用于PAL活力測定。同時陰干桑葉，粉碎，過20目篩用于總黃酮積累量測定。

對照品蘆丁（100080-200707） 中國食品藥品檢定研究院；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

AE240分析天平 上海梅特勒-托利多儀器有限公司；HHS-1恒溫水浴鍋 上海浦東躍欣科學儀器廠；ZF超聲波清洗機 上海致豐科技有限公司；Beckman冷凍離心機 北京東迅天地醫療儀器有限公司；超低溫冰箱上海實維實驗儀器技術有限公司；電熱恒溫鼓風干燥箱上海一恒科學儀器有限公司；UV-2550型紫外-可見分光光度計 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 PAL活力測定及條件優化

1.3.1.1 PAL活力測定

PAL活力測定方法參照陳雷等[14]方法并適當修改。稱取桑葉葉片0.2 g，加入0.05 mol/L pH 8.8的硼砂-鹽酸緩沖液（含巰基乙醇5 mmol/L）6 mL，聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone，PVP）0.2 g，在冰浴中研磨勻漿，勻漿液于4 ℃、12 000 r/min條件下離心15 min。取0.2 mL上清液、0.02 mol/L 1 mL苯丙氨酸、0.05 mol/L 3.8 mL硼砂-鹽酸緩沖液檢測PAL活力。對照組不加苯丙氨酸只加0.2 mL上清液、4.8 mL硼砂-鹽酸緩沖液。混勻后置30 ℃恒溫水浴中靜置30 min，加入6 mol/L 0.5 mL鹽酸溶液終止反應。在290 nm波長處測吸光度（A290nm），以每小時A290nm值變化0.1為一個酶活力單位（U），按下式計算PAL活力。

式中：VT為反應液的總體積/mL；Vt為提取上清液（粗酶液）的體積/mL；Vs為測定時粗酶液的用量/mL；m為樣品的質量/g；t為反應時間/h。

1.3.1.2 正交試驗設計優化PAL活力測定條件

在單因素試驗的基礎上，以PAL活力為響應值，對影響PAL活力的底物濃度、水浴時間、水浴溫度進行三因素三水平的正交試驗，確定測定經霜前后桑葉樣品PAL活力的最佳條件。

1.3.2 桑葉總黃酮積累量測定

1.3.2.1 蘆丁對照品溶液的制備

精密稱取105 ℃干燥至恒質量的蘆丁對照品12.9 mg，加體積分數70%乙醇溶解，定容至50 mL，得質量濃度為258 μg/mL的蘆丁對照品溶液，備用。

1.3.2.2 樣品溶液的制備

稱取桑葉藥材粉末1.0 g，加20 倍生藥量的70%乙醇溶液，85 ℃回流提取2 次，每次2 h。合并2次提取液，過濾，濾液定容至50 mL容量瓶中，用70%乙醇稀釋至刻度，得樣品溶液，備用。

1.3.2.3 蘆丁標準曲線的繪制

精密量取對照組溶液0.0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL置于10 mL容量瓶，分別加入0.3 mL 5 g/100 mLNaNO2溶液后搖勻放置6 min，再加入0.3 mL 10 g/100 mL Al(NO3)3溶液后搖勻放置6 min，4 mL 4 g/100 mL NaOH溶液后搖勻放置15 min，最后用70%乙醇溶液定容至刻度，于510 nm波長處測定吸光度，以蘆丁對照組質量濃度x對吸光度y進行線性回歸，得回歸方程為y＝0.011 3x-0.001 1，R2＝0.999 9。結果表明，在12.9～103.2 μg/mL之間蘆丁質量濃度與吸光度呈良好線性關系。

1.3.2.4 桑葉總黃酮積累量測定[15]

取23 批次桑葉樣品，按1.3.2.2節方法制備樣品溶液，測定其吸光度，并計算桑葉中總黃酮積累量。

1.3.3 經霜前后桑葉PAL活力的動態變化與平均氣溫的相關性分析

以經霜前后對應日期的平均氣溫作圖，得到不同日期平均氣溫的變化趨勢圖。采用SPSS 20.0軟件進行PAL活力與平均氣溫的相關性分析，考察氣候溫度對桑葉PAL活力的影響。

1.3.4 經霜前后桑葉PAL活力的動態變化與總黃酮積累量相關性分析

采用SPSS 20.0 軟件分析桑葉經霜前后PAL活力與總黃酮積累量的相關性。

1.4 數據處理

桑葉PAL活力測定和總黃酮積累量測定實驗重復3次，結果以±s表示。正交試驗方差分析采用Excel 2010軟件，相關性分析采用SPSS 20.0軟件。

2 結果與分析

2.1 經霜前后桑葉PAL活力測定及條件優化

2.1.1 正交試驗結果

表1 正交試驗設計及結果Table 1 Orthogonal with experimental

表2 正交試驗方差分析Table 2 Analysis of variance of the orthogonal array design

由表1可知：RA＞RC＞RB，各因素對桑葉PAL活力影響大小依次為：底物濃度＞水浴溫度＞水浴時間。此結果與表2的方差分析結果一致。底物濃度和水浴溫度對桑葉PAL活力影響極顯著（P＜0.01）；水浴時間影響不顯著。故根據表1中k值可以得到PAL活力最佳測定件為A2B2C2。

按以上A2B2C2條件做3 次平行實驗，桑葉PAL活力為142.26 U/g，表明該優化試驗方案可行。故最終確定桑葉PAL活力測定條件為：固定pH 8.8、0.05 mol/L的硼砂-鹽酸緩沖液為提取液，加入0.2 g/6 mL的PVP，底物L-苯丙氨酸濃度為0.04 mol/L，水浴溫度為40 ℃，水浴時間為40 min。

2.1.2 經霜前后桑葉PAL活力和總黃酮積累量

表3 經霜前后桑葉PAL活力和總黃酮積累量Table 3 PAL activity and total flavonoid content in mulberry leaves harvested before and after frost

由表3可知，不同生產季節的23 批桑葉PAL活力處于動態變化中。桑葉PAL活力在2015年4—5月份較高，之后隨氣溫升高有所下降，到8月份活力達到最低。9月份后PAL活力逐漸上升，特別是霜降（10月23日）后桑葉PAL活力增加明顯。桑葉中總黃酮積累量與生長季節有關，4月份積累量較高，5月份之后積累量逐漸降低，8月份積累量達到最低，9月份之后積累量又逐漸升高，11月15號總黃酮積累量達到最高值，為43.5 mg/g。

2.2 桑葉經霜前后PAL活力的動態變化與氣候溫度的相關性分析

圖1 經霜前后桑葉PAL活力及平均氣溫變化Fig. 1 Changes in PAL activity in mulberry leaves and average temperature before and after frost

由圖1可知，在溫度較低的4—5月份PAL活力較高，隨著氣溫的升高，PAL活力降低。溫度最高的8月份PAL活力降到最低。隨后溫度逐漸下降，PAL活力逐步上升。

PAL活力與平均溫度呈極顯著負相關，相關系數為-0.614。推測經霜前后環境溫度變化影響PAL活力，較低的平均氣溫有利于PAL活力的增加。

2.3 桑葉經霜前后PAL活力的動態變化與總黃酮積累量相關性分析

圖2 經霜前后桑葉PAL活力及總黃酮積累量變化圖Fig. 2 Changes in PAL activity and total flavonoid content in mulberry leaves before and after frost

由圖2可知，經霜前后桑葉PAL活力和總黃酮積累量變化趨勢基本一致。4—5月份時PAL活力較高，總黃酮積累量也高；5月份之后PAL活力逐漸降低，8月達到最低，總黃酮積累量也逐漸下降至8月份達到最低；9月份后PAL活力又逐漸上升，總黃酮積累量也同樣上升。

PAL活力與總黃酮積累量呈極顯著正相關，相關系數為0.660（P＜0.01）。該分析結果表明，在桑葉黃酮類化合物的生物合成途徑中PAL是合成關鍵酶，PAL活力的增加可以促使桑葉中黃酮類物質增加。

3 討 論

桑葉為疏散風熱、清肺潤燥、清肝明目的常用中藥，藥用以采收于初霜后為佳。有研究表明桑葉中總黃酮積累量在霜降后會繼續上升[16-18]。本課題組前期研究了桑葉經霜前后次生代謝產物的表達差異，發現桑葉經霜后黃酮類物質積累量顯著升高，同時發現氣候溫度與總黃酮積累量呈極顯著負相關[3]。且相關研究也表明較低的平均溫度有利于黃酮類物質的積累，主要原因可能是低溫可以使總黃酮合成途徑中相關酶的活力大幅度提高[8-9]。

PAL是參與桑葉生合成途徑中黃酮類物質形成的第1個關鍵酶，且PAL是一種誘導酶，受多種外界因素的誘導。各種類型的低溫[19-20]、機械損傷[21]、CO2[22]等都可以誘導PAL基因的表達，影響其活力。本實驗優化了桑葉PAL活力測定條件，采用6 mL pH 8.8、0.1 mol/L的硼砂-鹽酸緩沖液，加入0.2 g桑葉葉片、0.2 g PVP，底物L-苯丙氨酸濃度為0.04 mol/L、40 ℃條件下水浴反應40 min。采用優化PAL活力測定條件分析了不同生長季節及經霜前后桑葉PAL活力的動態變化規律。結果表明不同生長季節桑葉中PAL活力在4—5月份較高，之后隨氣溫升高有所下降，到8月份活力達到最低。9月份后隨氣溫下降，PAL活力逐漸上升，特別是霜降節氣（霜降10月23日）后桑葉PAL活力增加明顯。

對不同生長季節及經霜前后桑葉PAL活力的動態變化與總黃酮積累量及氣候溫度進行相關性分析，結果顯示，不同季節桑葉中PAL活力與氣溫呈極顯著負相關，與總黃酮積累量呈極顯著正相關（P＜0.01）。桑葉經霜前后主要是環境溫度發生變化，溫度是影響植物生長發育的重要影響因素之一[23-24]。外界溫度的改變，將影響植物細胞內脅迫蛋白的表達，尤其是調控包括碳水化合物的生物合成與代謝在內的能量代謝途徑，調整自身的生理狀態以適應環境[25]。本課題組研究結果證實低溫可以誘導桑葉生合成途徑中PAL活力，有利于黃酮類物質的積累。經霜對桑葉生合成途徑黃酮類功效物質和其他相關酶活力及基因表達的影響正在進一步研究之中，為從植物生源途徑闡明經霜過程對桑葉功效物質影響的科學內涵提供了一定的實驗依據。

[1] 南京中醫藥大學. 中藥大辭典(下冊)[M]. 2版. 上海: 上海科學技術出版社, 2005: 2779.

[2] 歐陽臻, 陳鈞. 桑葉的化學成分及其藥理作用研究進展[J]. 江蘇大學學報(自然科學版), 2003, 24(6): 39-44. DOI:10.3969/ j.issn.1671-7775.2003.06.010.

[3] 張魏琬麒, 歐陽臻, 趙明, 等. 桑葉經霜前后次生代謝產物表達差異研究[J]. 食品科學, 2015, 36(8): 109-114. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201508019.

[4] DOI K, KOJIMA T, MAKINO M, et al. Studies on the constituents of the leaves of Morus alba L.[J]. Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 2001, 49(2): 151-153. DOI:10.1248/cpb.49.151.

[5] 邱進, 王曉靜, 王元書, 等. 桑葉化學成分的研究[J]. 中成藥, 2008, 30(9): 1-2. DOI:10.3969/j.issn.1001-1528.2008.09.056.

[6] 王曉靜, 王元書, 邱進, 等. 桑葉化學成分研究[J]. 食品與藥品, 2007(1): 9. DOI:10.3969/j.issn.1672-979X.2007.09.001.

[7] NGUYEN T D, PHUNG T X B, LE T P Q, et al. Cytotoxic prenylated flavonoids from Morus alba[J]. Fitoterapia, 2010, 81(8): 1224-1227. DOI:10.1016/j.fitote.2010.08.006.

[8] AZUMA A, YAKUSHIJI H, KOSHITA Y, et al. Flavonoid biosynthesis-related genes in grape skin are differentially regulated by temperature and light conditions[J]. Planta, 2012, 236(4): 1067-1080. DOI:10.1007/s00425-012-1650-x.

[9] WANG Guibin, CAO Fuliang, CHANG Li, et al. Temperature has more effects than soil moisture on biosynthesis of flavonoids in Ginkgo (Ginkgo biloba L.) leaves[J]. New Forests, 2014, 45(6): 797-812. DOI:10.1007/s11056-014-9437-5.

[10] HOLGER R, GEORG E S. Structural basis for the entrance into the phenylpropanoid metabolism catalyzed by phenylalanine ammonialyase[J]. Plant Cell, 2004, 16(12): 3426-3436. DOI:10.1105/ tpc.104.025288.

[11] 徐文燕, 高微微, 何春年. 環境因子對植腸黃酮類化合物生物合成的影響[J]. 世界科學技術(中醫藥現代化), 2006, 8(6): 68-72.

[12] 王莉, 史玲玲, 張艷霞, 等. 植物次生代謝物途徑及其研究進展[J]. 武漢植物學研究, 2007, 25(5): 500-508. DOI:10.3969/ j.issn.2095-0837.2007.05.015.

[13] CHEYNIER V, COMTE G, DAVIES K M, et al. Plant phenolics: recent advances on their biosynthesis, genetics, and ecophysiology[J]. Plant Physiology and Biochemistry, 2013, 72: 1-20. DOI:10.1016/ j.plaphy.2013.05.009.

[14] 陳雷, 常麗, 曹福亮, 等. 銀杏葉黃酮類化合物含量及相關酶活性對溫度和干旱脅迫的響應[J]. 西北植物學報, 2013, 33(4): 755-762.

DOI:10.3969/j.issn.1000-4025.2013.04.017.

[15] 徐秀泉, 許源, 湯建, 等. 響應面法優化金蓮花總黃酮的超聲提取工藝[J]. 中國實驗方劑學雜志, 2011, 17(14): 35-38. DOI:10.3969/ j.issn.1005-9903.2011.14.011.

[16] 游元元, 萬德光. 川產桑葉“經霜為上”合理性的LC-MS法驗證[J]. 時珍國醫國藥, 2011, 22(11): 2596-2598. DOI:10.3969/ j.issn.1008-0805.

[17] 張麗麗, 白永亮, 宿樹蘭, 等. 不同品種不同生長期桑葉中生物堿類與黃酮類化學成分的積累動態分析評價[J]. 中國中藥雜志, 2014, 39(24): 4822-4828. DOI:10.4268/cjcmm20142424.

[18] 李瑞雪, 王鈺婷, 胡飛, 等. 桑樹總黃酮含量變化規律分析[J]. 中國蠶業, 2015, 36(4): 30-34. DOI:10.3969/j.issn.1007-0982.2015.04.006.

[19] LEYVA A, JARILLO J A, SALINAS J, et al. Low temperature induces the accumulation of phenylalanine ammonia-lyase and chalcone aynthase mRNAs of Arabidiopsis thaliana in a light-dependent manner[J]. Plant Physiology, 1995, 108(1): 39-46.

[20] LENG P, ITAMURA H, YAMAMURA H. Changes of phenylalanine ammonia-lyase (PAL) activity in twig tussues of two Diospyros species during cold acclimation[J]. Environment Control in Biology, 1995, 33(1): 43-48. DOI:10.2525/ecb1963.33.43

[21] BROWN G E. Changes in phenylalanine ammonia-lyase, soluble phenolics and lignin in injured orange exocarp[A]. Proceeding of the Annual Meeting of the Florida State Horticulture Society, 1990, 103: 234-237.

[22] JAAFAR H Z, IBRAHIM M H, KARIMI E. Phenolics and flavonoids compounds, phenylanine ammonia lyase and antioxidant activity responses to elevated CO2in Labisia pumila (Myrisinaceae)[J]. Molecules, 2012, 17(6): 6331-6347. DOI:10.3390/molecules17066.

[23] 李彥, 周曉東, 樓浙輝, 等. 植物次生代謝產物及影響其積累的因素研究綜述[J]. 江西林業科技, 2012(3): 54-60. DOI:10.3969/ j.issn.1006-2505.2012.03.018.

[24] 侯婭, 馬陽, 鄒立思, 等. 生態因子對藥用植物次生代謝物的影響及其研究方法[J]. 時珍國醫國藥, 2015, 26(1): 187-190. DOI:10.3969/ j.issn.1008-0805.2015.01.076.

[25] 龔映雪. 植物響應溫度脅迫蛋白質組學研究進展[J]. 安徽農業科學, 2010, 38(32): 18038-18040. DOI:10.3969/ j.issn.0517-6611.2010.32.020.

Mulberry Leaves Harvested before and after Frost: Correlation between Phenylalanine Ammonia Lyase Activity and Total Flavonoid Content as well as Air Temperature

YU Xiaofeng1,2, LI Yunzhu3, ZHANG Weiwanqi2, WANG Dujun2, WEI Yuan2, OUYANG Zhen2,*
(1. School of Food and Biological Engineering, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China; 2. School of Pharmacy, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China; 3. Jingjiang College, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China)

In order to explore the mechanism underlying the influence of frost on the total flavonoid content in mulberry leaves, the dynamic changes in phenylalnine ammonia lyase (PAL) activity as a key enzyme in the biosynthesis of flavonoids was analyzed in mulberry leaves harvested before and after frost as well as the correlation between PAL activity and total flavonoid content or air temperature. For the determination of PAL activity in mulberry leaves, 0.2 g mulberry leaf powder was homogenized with 0.1 mol/L borax hydrochloric acid buffer (6 mL, pH 8.8) added with 0.2 g of polyethylene (PVP) and centrifuged, and the supernatant was allowed to react with 0.04 mol/L L-phenylalanine as substrate at 40 ℃for 40 min. At the same time, the total flavonoid content of mulberry leaves was measured by UV spectrophotometry. The results showed that PAL activity in mulberry leaves harvested after frost was higher than in those harvested before frost. PAL activity showed a very significantly negative correlation with temperature, whereas it was significantly positively correlated with total flavonoid content. Lower temperature had a significant positive effect on the accumulation of total flavonoids.

mulberry leaves; phenylalanine ammonialyase; frost; temperature; total flavonoids content

10.7506/spkx1002-6630-201621004

R932

A

1002-6630（2016）21-0021-05

于小鳳, 李韻竹, 張魏琬麒, 等. 桑葉經霜前后總黃酮積累量與苯丙氨酸解氨酶活力及氣溫相關性分析[J]. 食品科學, 2016, 37(21): 21-25. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201621004. http://www.spkx.net.cn

YU Xiaofeng, LI Yunzhu, ZHANG Weiwanqi, et al. Mulberry leaves harvested before and after frost: correlation between phenylalanine ammonia lyase activity and total flavonoid content as well as air temperature[J]. Food Science, 2016, 37(21): 21-25. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201621004. http://www.spkx.net.cn

2015-12-08

國家自然科學基金面上項目（81072985；81373480；81573529）；江蘇大學第14批大學生科研立項一般項目（14A045）

于小鳳（1979—），女，副教授，博士研究生，研究方向為中藥活性成分。E-mail：coler@ujs.edu.cn

*通信作者：歐陽臻（1964—），女，教授，博士，研究方向為中藥資源活性成分及新藥開發。E-mail：zhenouyang@ujs.edu.cn