谷氨酸棒狀桿菌果糖代謝阻斷工程菌的構建

許湄雪，王北辰，劉金雷，范 榮，陸 浩，韓武洋，李天明,*，馮惠勇

（1.河北科技大學生物科學與工程學院，河北 石家莊 050018；2.威斯康星大學，威斯康星 麥迪遜 53706，美國）

谷氨酸棒狀桿菌果糖代謝阻斷工程菌的構建

許湄雪1，王北辰2，劉金雷1，范 榮1，陸 浩1，韓武洋1，李天明1,*，馮惠勇1

（1.河北科技大學生物科學與工程學院，河北 石家莊 050018；2.威斯康星大學，威斯康星 麥迪遜 53706，美國）

谷氨酸棒狀桿菌不僅可以利用葡萄糖和果糖作為碳源進行糖類代謝，也可以利用這些碳源作為底物生產葡萄糖酸、甘露醇及山梨醇等產品。為了提高底物利用率和目的產物的積累量，利用代謝工程阻斷糖類代謝的磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸轉移酶系統（phosphoenolpyruvate carbohydrate phosphotransferase system，PTS）和失活相應磷酸激酶。是實現此目標的有效手段。本實驗利用同源重組和反向篩選等技術手段，分別獲得ptsF單基因缺失工程菌CGΔptsF和ptsF、ptsH、ptsI三基因缺失工程菌CGΔptsFΔptsHΔptsI。工程菌的生長情況研究表明：在以葡萄糖為唯一碳源的培養基上，工程菌CGΔptsF和工程菌CGΔptsFΔptsHΔptsI與野生型生長情況基本一致，說明葡萄糖代謝不受3 個基因影響；在以蔗糖為唯一碳源的培養基上，工程菌CGΔptsF和工程菌CGΔptsFΔptsHΔptsI的生長速率分別是野生型的48.4%和29.7%，菌體濃度分別是野生型的61.6%和34.1%；在以果糖為唯一碳源的培養基上，工程菌CGΔptsF菌體濃度是野生型43.2%，工程菌CGΔptsFΔptsHΔptsI生長為0，證明其完全阻斷了果糖代謝，同時說明果糖的PTS系統受ptsF、ptsH和ptsI基因編碼的PTS相關蛋白的聯合控制。果糖代謝阻斷工程菌的獲得，為進一步構建以果糖原型為底物的甘露醇或山梨醇生產工程菌株提供了遺傳資源，也為谷氨酸棒狀桿菌的糖類代謝研究提供了理論依據。

谷氨酸棒狀桿菌；基因敲除；磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸轉移酶系統

谷氨酸棒狀桿菌（Corynebacterium glutamicum）是食品級微生物之一，在氨基酸產品、蛋白質產品、其他化學產品的生產中扮演者非常重要的角色，廣泛應用于生物轉化、食品添加劑、動物飼料、化妝品、醫藥衛生等領域[1-2]，特別是被廣泛用于谷氨酸、賴氨酸的生產[3]。隨著谷氨酸棒狀桿菌ATCC 13032全基因組的測序，揭示了這種微生物以前未知的代謝調控網絡和功能，使我們可以通過代謝工程手段定向改造谷氨酸棒狀桿菌，作為細胞工廠生產更多的生物制造產品的目標得以實現[4-7]。

谷氨酸棒狀桿菌在工業生產中，利用農副產品提供葡萄糖、蔗糖和果糖作為碳源[8]，為生長提供能量。同時作為細胞工廠，谷氨酸棒狀桿菌也可以利用這些糖類物質的原型作為底物生產有價值的產品，例如：由葡萄糖生產葡萄糖酸、由果糖生產甘露醇、由果糖生產山梨醇等[9-10]。但是，這些糖類往往通過磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸轉移酶系統（phosphoenolpyruvate carbohydrate phosphotransferase system，PTS）被微生物所攝取，并通過磷酸化后進入糖酵解途徑被代謝，或者通過ATP-binding cassette transporter（ABC）轉運系統將其原型轉運進入細胞，再在磷酸化激酶的作用下磷酸化后被代謝[11-14]。所以，阻斷兩種形式的磷酸化途徑，阻止糖類以碳源的形式被代謝，將有利于底物利用率的提高和目標產物的積累[15-18]。

本實驗以谷氨酸棒狀桿菌ATCC 13032為出發菌，通過兩次同源重組和蔗糖致死基因sacB反向篩選技術進行基因的無痕敲除：第1次重組時，打靶質粒上的同源臂與染色體組發生重組，利用抗性篩選，打靶質粒被整合到染色體上；第2次重組時，打靶質粒上未發生重組的同源臂與基因外側同源臂發生重組，利用sacB基因反向篩選出同源臂間的目的基因被無痕敲除的菌株[19]，采用此方法分別敲除了果糖被代謝的PTS系統，構建了ptsF、ptsH、ptsI基因缺失工程菌，阻斷了其對果糖的代謝，為進一步構建以果糖原型為底物的甘露醇或山梨醇生產工程菌株提供了遺傳資源，也為谷氨酸棒狀桿菌的糖類代謝的研究提供了理論依據。

1 材料與方法

1.1 試劑與培養基

Hi-Fi DNA聚合酶 北京全式金生物技術有限公司；限制性內切酶EcoR I、BamH I、Xba I、Not I NEB（北京）有限公司；T4 DNA 連接酶 寶生物工程（大連）有限公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、DNA純化回收試劑盒、質粒小提中量試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司；Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒 生工生物工程（上海）股份有限公司。聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

LB培養基：胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、NaCl 10 g/L，pH 6.4～6.7，121 ℃滅菌20 min。LB固體培養基，加入20 g/L的瓊脂。必要時加入終質量濃度為30 mg/L的卡那霉素。

CD培養基（g/L）：磷酸二氫鉀1、硫酸銨3、硝酸銨1、硫酸鎂0.5、氯化鈣0.2、硫酸鐵0.01 、硫酸錳0.01、硫酸銅0.002、硫酸鋅0.001、生物素0.002，pH 6.4～6.7，0.2 μm過濾除菌。

孵育培養基：CD培養基中加入乙酸鈉50 g/L、乳酸鈉50 g/L，pH 6.4～6.7，0.2 μm過濾除菌。

本研究所涉及的菌株及質粒如表1所示，相關引物序列如表2所示。

表1 實驗所用菌株及質粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

表2 實驗所用引物Table 2 Primers used in this study

1.2 儀器與設備

PCR儀 德國Eppendorf公司；全自動凝膠成像系統、GenePulser XcellTM電轉儀 美國Bio-Rad公司；高速冷凍離心機、DYY-6C電泳儀 北京市六一廠；HWS型培養箱 寧波江南儀器廠；恒溫金屬浴 杭州博日科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 打靶質粒的構建

本實驗用于敲除ptsF、ptsH和ptsI基因的打靶質粒利用如下方法構建：以敲除ptsF基因為例，首先以谷氨酸棒狀桿菌ATCC 13032菌株基因組為模板，通過PCR擴增出ptsF基因上游下游同源臂片段，通過融合PCR得到目的片段 ptsF，片段經純化后，與pK18mobsacB質粒同時進行EcoR I、BamH I雙酶切，酶切產物回收后，經T4連接酶16 ℃過夜連接，轉化至E. coli Trans5a，篩選陽性轉化子，提取質粒進行PCR驗證，測序，最終得到打靶質粒pK18mobsacB/ΔptsF。構建示意圖如圖1所示。利用類似構建方法又得到同時敲除ptsH、ptsI基因的打靶質粒pK18mobsacB/Δpts5。

圖1 pK18mobsacB/Δpts F構建示意圖Fig. 1 Construction of pK18mobsacB/ΔptsF

1.3.2 工程菌的構建

谷氨酸棒桿菌感受態細胞制備參考van der Rest[20]和Hu[21]等的研究方法，取約5 μg打靶質粒與40 μL感受態細胞輕輕混合，轉入電擊杯，進行電擊（電擊條件為2.5 kV/cm電壓、250 Ω電阻、25 μF電容、2 mm電擊杯）。電擊完成后，30 ℃、180 r/min孵育培養4 h，涂布于含有卡那霉素抗性的固體培養基上，30 ℃，培養約40 h，固體培養基平板上長出均勻單菌落，挑取單菌落進行篩選。

1.3.3 工程菌的篩選

將平板培養基上長出的單菌落擴培至含卡那霉素抗性的固體平板培養基上，振蕩裂解后進行菌落PCR驗證，確認打靶質粒經同源重組成功整合到染色體上。選取驗證正確的轉化子，在無抗性壓力條件下振蕩培養6 h，稀釋涂布于含有10%蔗糖的固體平板培養基上，利用蔗糖致死基因sacB反向篩選出發生第二次同源重組的轉化子，挑取蔗糖平板培養基上單菌落，分別影印在卡那霉素抗性平板培養基及10%蔗糖平板培養基上，30 ℃培養約40 h。選取在卡那霉素抗性平板培養基上不生長而對應蔗糖平板培養基上生長的單菌落，擴培，通過設計相對應的驗證引物來進行菌落PCR驗證，從而獲得陽性工程菌。

1.3.4 工程菌生長情況的研究

將工程菌和谷氨酸棒狀桿菌ATCC 13032菌株進行搖瓶發酵。工程菌和谷氨酸棒狀桿菌ATCC 13032菌株分別挑取1 環至西林瓶，無菌生理鹽水重懸，調節至光密度（OD）值基本一致，接種于CD加唯一碳源的培養基中，30 ℃，180 r/min，不同時間取樣，觀測其生長情況，在600 nm波長處測定光密度值，以體現菌體濃度。

2 結果與分析

2.1 ptsF基因缺失菌株的構建及驗證

2.1.1 ptsF打靶質粒的構建

以谷氨酸棒狀桿菌ATCC 13032基因組為模板，通過PCR技術擴增ptsF基因上下同源臂，又利用融合PCR獲得目的片段，與pK18mobsacB連接，得到重組質粒pK18mobsacB/ΔptsF。分別利用擴增上下同源臂時設計的引物PTSFUPF/PTSFUPR和PTSFDOF/PTSFDOR對重組質粒pK18mobsacB/ΔptsF進行PCR驗證，結果如圖2所示，兩對引物分別擴增出大小1 050 bp和1 100 bp片段，與谷氨酸棒狀桿菌ATCC 13032基因組擴增的大小一致，且空白陰性對照（水為模版）無條帶，說明重組質粒pK18mobsacB/ΔptsF構建成功。

圖2 pK18mobsacB/ΔptsF質粒PCR驗證Fig. 2 Identification of plasmid pK18mobsacB/Δ圖2pK18mobsacB/Δpts

2.1.2 CGΔptsF工程菌的篩選

將重組質粒pK18mobsacB/ΔptsF電擊轉化至谷氨酸棒狀桿菌ATCC 13032感受態細胞，利用兩次同源重組方法和sacB基因反向篩選技術來實現基因的無痕敲除，基因重組過程示意圖如圖3所示。

圖3 利用sacB系統進行基因敲除過程示例Fig. 3 Gene deletion procedure based on sacB system

按照谷氨酸棒狀桿菌ATCC 13032被敲除的ptsF基因序列設計敲除驗證引物QPTSFYZF/QPTSFYZR，分別以CGΔptsF菌株、谷氨酸棒狀桿菌ATCC 13032菌株的基因組DNA為模板，進行PCR驗證，結果如圖4所示，谷氨酸棒狀桿菌ATCC 13032菌株擴增出大小為520 bp的ptsF基因片段，CGΔptsF菌株沒有擴增出相應片段，并且空白陰性（水為模版）對照無條帶，說明CGΔptsF工程菌基因組中的ptsF基因已被敲除。

圖4 CGΔpts F基因組PCR驗證Fig. 4 Identification ofCGΔpts F ptsF deletion by PCR

2.1.3 CGΔptsF工程菌生長狀況

CGΔptsF及谷氨酸棒狀桿菌ATCC 13032在以果糖為唯一碳源的條件下搖瓶發酵，測定生長曲線，結果如圖5所示。由這兩條生長曲線可以看出，敲除ptsF基因的突變株與野生型在延滯期生長速率開始降低，生長緩慢，最終生物量比野生型明顯下降，表明敲除ptsF基因使菌株對果糖利用率降低，但仍能利用果糖繼續生長。

圖5 谷氨酸棒狀桿菌ATCC 13032與CGΔpts F在果糖為唯一碳源條件下的生長情況Fig. 5 Growth curves of C. glutamicum ATCC 13032 and CGΔptsF in fructose minimal medium

2.2 ptsH、ptsI基因缺失菌株的構建及驗證

2.2.1 ptsH、ptsI打靶質粒的構建

以谷氨酸棒狀桿菌ATCC 13032基因組為模板，通過PCR技術擴增ptsH、ptsI基因上下同源臂，又利用融合PCR獲得目的片段pts5，與pK18mobsacB連接，得到重組質粒pK18mobsacB/Δpts5。分別利用擴增上下同源臂時設計的引物PTS5UPF/PTS5UPR和PTS5DOF/PTS5DOR對重組質粒pK18mobsacB/Δpts5進行PCR驗證，結果如圖6所示，兩對引物分別擴增出大小1 000 bp和1 020 bp的片段，與谷氨酸棒狀桿菌ATCC 13032基因組擴增的大小一致，且空白陰性對照（水為模版）無條帶，說明重組質粒pK18mobsacB/Δpts5構建成功。

圖6 pK18mobsacB/Δpts5質粒PCR驗證Fig. 6 Identification of plasmid pK18mobsacB/Δpts5 by PCR

2.2.2 CGΔptsFΔptsHΔptsI工程菌的篩選

將重組質粒pK18mobsacB/Δpts5電擊轉化至CGΔptsF感受態細胞中，利用兩次同源重組方法和sacB基因反向篩選技術來實現基因的無痕敲除，基因重組過程與圖3示例相似。

谷氨酸棒狀桿菌ATCC 13032基因組序列中被敲除的ptsH基因、ptsI基因為相鄰基因，按照其基因序列設計敲除驗證引物QPTS5YZF/QPTS5YZR，分別以CGΔptsFΔptsHΔptsI菌株與谷氨酸棒狀桿菌ATCC 13032菌株的基因組DNA為模板，進行PCR驗證，結果如圖7所示，谷氨酸棒狀桿菌ATCC 13032菌株擴增出大小為1 080 bp的ptsH、ptsI基因片段，CGΔptsFΔptsHΔptsI菌株沒有擴增出相應大小的片段，并且空白陰性對照（水為模版）無條帶，說明CGΔptsFΔptsHΔptsI工程菌基因組中的ptsH、 ptsI基因已被敲除。

圖7 CGΔptsFΔptsHΔptsI基因組PCR驗證Fig. 7 Identification of ptsF ptsH and ptsI deletion by PCR

2.2.3 CGΔptsFΔptsHΔptsI工程菌生長狀況

CGΔptsF、CGΔptsFΔptsHΔptsI及谷氨酸棒狀桿菌ATCC 13032在以果糖為唯一碳源的條件下搖瓶發酵，測定生長曲線，結果由圖8可知，進一步敲除ptsH和ptsI基因的突變株生長量幾乎為零，表明敲除ptsH和ptsI基因后，菌株不能利用果糖用生長。

圖8 谷氨酸棒狀桿菌ATCC 13032與CGΔptsFΔptsHΔpts I在果糖為唯一碳源條件下的生長情況Fig. 8 Growth curves of C. glutamicum ATCC 13032 and CGΔptsFΔptsHΔptsI in fructose minimal medium

2.3 谷氨酸棒狀桿菌ATCC 13032、CGΔptsF、CGΔptsFΔptsHΔptsI分別在不同碳源培養基中的生長情況

CD培養基中分別加入1%果糖、1%蔗糖、1%葡萄糖為唯一碳源，配制成3 種CD培養基，將谷氨酸棒狀桿菌ATCC 13032、CGΔptsF和CGΔptsFΔptsHΔptsI菌株分別等OD值接種，搖瓶發酵，測定生長曲線，結果如圖9所示。

圖9 野生菌與工程菌的生長情況Fig. 9 Growth curves of the wild strain and the engineered strains

由圖9可知，在果糖培養基中谷氨酸棒狀桿菌ATCC 13032生長良好，CGΔptsF生長減緩，菌體濃度降低，為谷氨酸棒狀桿菌ATCC 13032的43.2%，CGΔptsFΔptsHΔptsI不能生長，生長量為0。在蔗糖培養基中，谷氨酸棒狀桿菌ATCC 13032生長良好，CGΔptsF生長減緩，生長速率為谷氨酸棒狀桿菌ATCC 13032的48.4%，CGΔptsFΔptsHΔptsI生長更加微弱，為谷氨酸棒狀桿菌ATCC 13032的29.7%。在葡萄糖培養基中，3 株菌均生長良好，無明顯差異。

3 討 論

自從Mori和Shiio首次發現了谷氨酸棒狀桿菌中的PTS系統之后[10]，一些研究表明，蔗糖、果糖和葡萄糖通過PTS系統被谷氨酸棒狀桿菌利用，該系統參與細胞生長過程中對果糖等碳源的吸收、運輸和磷酸化過程[11]。據報道，PTS系統由特異性蛋白E1（由ptsH編碼）、搬運蛋白HPr（由ptsI編碼）和酶Ⅱ（EIIs）組成[9]。PEP代謝中的磷酰基團由E1傳遞至HPr、EIIs，最終到達葡萄糖，完成葡萄糖的磷酸化轉運。EIIs是由多種不同功能可特異性識別和轉運的蛋白組成，參與細胞中的磷酸化轉運工作[14-15]。PTS系統分為4 種，分別特異作用于葡萄糖、果糖、蔗糖和另外一種未知底物。其中葡萄糖-PTS系統由EIIGlc葡萄糖特異性EIIABC組件（由ptsG編碼）和2 個通用組件E1、HPr構成。果糖-PTS系統由EIIFru果糖特異性EIIABC組件（由ptsF編碼）構成。蔗糖-PTS系統則由EIIsuc蔗糖特異性EIIABC組件（由ptsS編碼）構成[17-18]。

本研究利用基因工程構建工程菌，改變其代謝途徑已經成為非常普遍而又有效的方法。本實驗以谷氨酸棒狀桿菌ATCC 13032為出發菌，利用融合PCR等分子操作構建用于打靶的重組質粒，利用2 次同源重組的原理對目的基因ptsF進行敲除，通過基因組PCR驗證基因缺失菌株CGΔptsF。該基因缺失菌株在以果糖為唯一的培養基上的生長速率低于野生型，菌株對果糖的利用率降低，ptsF基因的敲除對菌株生長造成了一定影響，但仍保留了運輸果糖的能力，說明果糖的轉運除了由ptsF編碼的EIIFru果糖特異性EIIABC組件[17]以外，還存在著其他轉運磷酸化系統。

在CGΔptsF基礎之上，實驗又進一步敲除了ptsH和ptsI基因簇，它們分別編碼特異性蛋白E1和搬運蛋白HPr[9]，獲得CGΔptsFΔptsHΔptsI工程菌株，該工程菌在果糖為唯一碳源的培養基上，生長速率為0，完全阻斷了果糖的PTS運輸系統。而Moon等[15]在谷氨酸棒狀桿菌ATCC 13032敲除ptsF基因基礎上，進一步敲除ptsG基因后，在果糖為唯一碳源的培養基上不再生長。本研究報道了谷氨酸棒狀桿菌ATCC 13032的果糖運輸由果糖-PTS系統EIIFru果糖特異性EIIABC組件和PTS系統特異性蛋白E1及搬運蛋白HPr共同構成。另外，發現ptsF、ptsH和ptsI基因的敲除，也影響了蔗糖代謝，可能的原因是蔗糖在EIIsuc蔗糖特異性EIIABC組件（由ptsS編碼）作用下成為6-P-蔗糖，水解產生果糖和6-P-葡萄糖，6-P-葡萄糖被代謝利用，果糖被分泌到胞外，而ptsF、ptsH和ptsI基因缺失工程菌已阻斷了果糖的代謝，只有6-P-葡萄糖支撐了菌體生長，由此也影響了蔗糖的代謝。Moon等[12]發現ptsF基因缺失菌株在蔗糖為唯一碳源的培養基上培養時，檢測到培養基中有果糖積累，當培養基中蔗糖耗盡時，果糖量不再增加，轉為碳源繼續維持菌體生長，果糖量逐漸降低。這個結論也從另一角度證實了本研究的結論。

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Construction of Engineered Strain of Corynebacterium glutamicum Capable of Blocking Fructose Metabolism

XU Meixue1, WANG Beichen2, LIU Jinlei1, FAN Rong1, LU Hao1, HAN Wuyang1, LI Tianming1,*, FENG Huiyong1
(1. College of Biological Science and Engineering, Hebei University of Science and Technology, Shijiazhuang 050018, China; 2. University of Wisconsin, Madison 53706, USA)

Corynebacterium glutamicum is a food-grade microorganism widely used to produce amino acids, proteins and other chemical products in the fields of biological transformation, food additives, animal feed, cosmetics, medicine and health care. It can not only use glucose and fructose as the carbon sources, but also can use them as the substrates to produce gluconic acid, mannitol, sorbitol and other products. Blocking sugar metabolism in which the phosphoenolpyruvate carbohydrate phosphotransferase system (PTS) and phosphokinase are involved through metabolic engineering is an effective avenue to improve substrate utilization and the accumulation of desired products. In this research, the mutant strains CGΔptsF lacking the ptsF gene and CGΔptsFΔptsHΔptsI lacking the ptsF, ptsH and ptsI genes were constructed by homologous recombination and reverse screening. It was shown that both CGΔptsF and CGΔptsFΔptsHΔptsI were grown in medium with glucose as the only carbon source, while glucose metabolism was not affected by the lack of these three genes. Compared to the wild-type strain, the growth rates of CGΔptsF and CGΔptsFΔptsHΔptsI were 48.4% and 29.7% and cell concentrations of CGΔptsF and CGΔptsFΔptsHΔptsI were 61.6% and 34.1%, respectively, when the mutant strains were grown in medium using sucrose as the sole carbon source. However, when they were grown using fructose as the sole carbon source, the growth rates of CGΔptsF and CGΔptsFΔptsHΔptsI were 43.2% and 0 compared to the wild-type strain. It turned out that the fructose PTS system was controlled by combination of the ptsF, ptsH and ptsI genes encoding proteins associated with PTS. These engineered bacteria capable of blocking fructose metabolism can provide a genetic resource to construct mannitol or sorbitol-producing strains with fructose as the substrate and also lay the theoretical basis for the study of carbohydrate metabolism in Corynebacterium glutamicum.

Corynebacterium glutamicum; gene knockout; phosphoenolpyruvate carbohydrate phosphotransferase system (PTS)

10.7506/spkx1002-6630-201621027

Q789

A

1002-6630（2016）21-0157-07

許湄雪, 王北辰, 劉金雷, 等. 谷氨酸棒狀桿菌果糖代謝阻斷工程菌的構建[J]. 食品科學, 2016, 37(21): 157-163.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201621027. http://www.spkx.net.cn

XU Meixue, WANG Beichen, LIU Jinlei, et al. Construction of engineered strain of Corynebacterium glutamicum capable of blocking fructose metabolism[J]. Food Science, 2016, 37(21): 157-163. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201621027. http://www.spkx.net.cn

2015-11-26

國家高技術研究發展計劃（863計劃）項目（2014AA022102）

許湄雪（1989—），女，碩士研究生，研究方向為合成生物學與代謝工程。E-mail：646653447@qq.com

*通信作者：李天明（1986—），男，助理研究員，碩士，研究方向為合成生物學與代謝工程。E-mail：iamltm2000@hotmail.com