響應面優化魷魚須脫皮液膠原肽酶解工藝及抗氧化活性

羅春艷，吳楊陽，孫海燕,2，余 輝，江旭華，陳小娥,2,*

（1.浙江海洋大學食品與醫藥學院，浙江 舟山 316022；2.浙江省水產品加工技術研究聯合重點實驗室，浙江 舟山 316022；3.浙江富丹旅游食品有限公司，浙江 舟山 316104）

響應面優化魷魚須脫皮液膠原肽酶解工藝及抗氧化活性

羅春艷1，吳楊陽1，孫海燕1,2，余 輝1，江旭華3，陳小娥1,2,*

（1.浙江海洋大學食品與醫藥學院，浙江 舟山 316022；2.浙江省水產品加工技術研究聯合重點實驗室，浙江 舟山 316022；3.浙江富丹旅游食品有限公司，浙江 舟山 316104）

目的：研究秘魯魷魚須脫皮液膠原肽酶解工藝及抗氧化活性。方法：以水解度和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除率為指標，利用單因素試驗和響應面法對其酶解工藝進行優化，并采用2,2’-聯氮-二（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（2,2’-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt，ABTS）自由基與·OH清除率及亞鐵還原能力評價其酶解產物抗氧化活性以及通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）和凝膠排阻色譜分析其分子質量分布。結果：最適酶解工藝為酶解溫度50 ℃、初始pH 7.4、底物蛋白質質量分數3.2%、酶解時間3.7 h、酶添加量3 000 U/g。在此條件下，水解度和酶解產物DPPH自由基清除率分別為（37.23±0.08）%和（43.61±0.09）%，對ABTS+·和·OH清除率的IC50分別為0.37 mg/mL和0.41 mg/mL，且表現出較強的亞鐵還原能力；SDS-PAGE顯示最適酶解工藝下，蛋白質基本被水解為小分子多肽；凝膠排阻色譜分析可知，酶解產物分子質量在1～5 kD之間。結論：酶解產物具備較強的抗氧化活性，可作為抗氧化活性物質基料，充分開發利用。

魷魚須脫皮液；酶解；抗氧化；水解度；半抑制濃度

我國遠洋捕撈魷魚種類主要有秘魯魷魚、阿根廷魷魚和北太平洋魷魚。秘魯魷魚是至今為止發現個體最大、資源最充足的原料之一，已成為浙江省水產加工的主要品種，僅2014年其捕撈量就高達37萬 t，占浙江省遠洋魷魚捕撈量一半以上[1-3]。因秘魯魷魚須表皮深黑、厚實、吸盤難脫除等問題，致使其深加工一直受到限制，因此，如何對其進行脫皮是秘魯魷魚須深加工目前面臨的首要問題[4-5]。課題組前期對魷魚須酶法脫皮工藝進行了深入研究，建立了秘魯魷魚須胰酶脫皮工藝[6]，該工藝已在當地企業逐步推廣應用。但在企業生產過程中產生了大量的脫皮液，其含有豐富的維生素、微量元素、不飽和脂肪酸和牛磺酸等營養物質[7]，一般直接排入城市污水處理系統，不僅浪費資源，而且還需支付昂貴的排污費用[8]。因此，對其進行有效開發利用，提高其附加值成為水產加工企業急需解決的問題。

目前，有關魷魚須脫皮廢液深加工利用的研究相對較少，如從魚糜漂洗液等廢水中回收蛋白質[9-11]或蛋白酶[12]；利用鯖魚罐頭蒸煮液開發調味品[13-15]或制備抗氧化肽[16]等。迄今為止，國內外有關魷魚須脫皮液深加工利用研究鮮見報道。研究表明，脫皮液中富含蛋白質，特別含有大量的膠原蛋白[17-18]。因此，針對魷魚須脫皮液的成分特性，本實驗利用商業化的膠原蛋白酶對其進行酶解以制備具有抗氧化活性的膠原肽，通過響應面法優化酶解工藝，并分析了最適工藝條件下酶解產物的抗氧化活性及通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）圖譜觀察酶解效果，利用凝膠排阻色譜分析其分子質量分布，以期為魷魚資源深度開發及其下腳料的綜合利用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

魷魚須脫皮液（-20 ℃冰箱保存） 浙江富丹旅游食品有限公司；膠原蛋白酶（2×105U/g）南寧龐博生物工程有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2,2’-聯氮-二（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（2,2’-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)diammonium salt，ABTS） 美國Sigma公司；其他化學試劑均為分析純國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

HH-601型超級恒溫水浴鍋 常州市頂新實驗儀器有限公司；BS110S型電子天平 德國賽多利斯公司；pHS-3B型精密pH計 上海精密科學儀器有限公司；UV-2800型紫外-可見分光光度計 尤尼柯（上海）儀器有限公司；AKTA purifier100蛋白純化系統 瑞典Amersham Biosciences公司。

1.3 方法

1.3.1 魷魚須脫皮液酶解單因素試驗

考察底物蛋白質質量分數、酶解時間及酶添加量對水解度和DPPH自由基清除率的影響。酶解基本條件為：酶解溫度50 ℃、初始pH 7.4、底物蛋白質質量分數3%、酶解時間3 h、酶添加量3 000 U/g（酶解溫度和初始pH值的固定水平根據酶的性質選定），其中單因素底物蛋白質質量分數設定為1%、2%、3%、4%、5%，酶解時間設定為1、2、3、4、5 h，酶添加量設定為1 000、2 000、3 000、4 000、5 000 U/g（以蛋白計）。待反應結束后，沸水浴滅酶10 min，冰浴冷卻，冷凍保存。

1.3.2 魷魚須脫皮液酶解工藝響應面優化試驗

在上述單因素試驗結果的基礎上，以水解度和酶解產物DPPH自由基清除率為響應值，選取底物蛋白質質量分數（A）、酶解時間（B）、酶添加量（C）為試驗因子，根據Box-Behnken試驗中心設計原理，利用軟件Design-Expert V 8.0.6對試驗結果進行響應面分析，獲得魷魚須脫皮液最佳酶解工藝條件。

1.3.3 指標測定

1.3.3.1 基本成分測定

蛋白質含量按GB 5009.5—2010《食品中蛋白質的測定》[19]中凱氏定氮的方法測定；羥脯氨酸含量按DB 37/T 2094—2012《水產品中羥脯氨酸含量的測定 高效液相色譜法》[20]中高效液相色譜的方法測定；脂肪含量按GB/T 9695.7—2008《肉與肉制品 總脂肪含量測定》[21]中酸解法的方法測定；總糖含量按GB/T 9695.31—2008《肉制品 總糖含量測定》[22]中分光光度法測定；灰分含量按GB 5009.4—2010《食品中灰分的測定》[23]的方法測定。

1.3.3.2 水解度測定

水解度按Guerard等[24]的方法測定。

1.3.3.3 抗氧化活性測定

DPPH自由基清除率按Tepe等[25]的方法測定；ABTS+·清除率按Wang Bin等[26]的方法測定；·OH清除率按Wang Jingfeng等[27]的方法測定；亞鐵還原能力采用鐵氰化鉀還原法[28]測定。

1.3.4 分子質量分布測定

SDS-PAGE按Gómez-Guillén等[29]的方法進行分析，酶解產物相對分子質量分布采用凝膠排阻色譜法[30]測定，洗脫體積-分子質量標準方程為：y＝16 966-722.35x，R2＝0.999 3。

1.4 數據處理

采用Origin Pro 8.5軟件繪圖，應用SPSS 17.0進行數據分析，采用Tukey法檢驗差異顯著性，顯著性水平為α＝0.05。

2 結果與分析

2.1 魷魚須脫皮液基本成分

表1 魷魚須脫皮液基本成分Table 1 Basic components of squid tentacle peeling liquid %

由表1可以看出，魷魚須脫皮液中主要成分為蛋白質，含量高達15.18%，而通過羥脯氨酸計算出膠原蛋白含量為10.08%，即膠原蛋白占總蛋白的66.40%，與王燕[31]的結果一致，由此可見魷魚須脫皮液中膠原蛋白含量高。因此，本實驗選用商業化膠原蛋白酶對其酶解，從而制備抗氧化活性膠原肽。

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 底物蛋白質質量分數對酶解產物水解度和DPPH自由基清除率的影響

圖1表明，酶解產物的水解度和DPPH自由基清除率均隨底物蛋白質質量分數的增加而增大，當底物蛋白質質量分數為3%時，其水解度和DPPH自由基清除率分別為34.27%和40.75%，進一步提高底物蛋白質質量分數，兩者均無顯著變化（P＞0.05），因此選用底物蛋白質質量分數為3%左右。

圖1 底物蛋白質質量分數對水解液水解度和DPPH自由基清除率的影響Fig. 1 Effect of substrate protein concentration on DPPH radical scavenging capacity and DH

2.2.2 酶解時間對酶解產物水解度和DPPH自由基清除率的影響

圖2 酶解時間對水解液水解度和DPPH自由基清除率的影響Fig. 2 Effect of hydrolysis time on DH and DPPH radical scavenging capacity

通過圖2發現，隨著酶解時間的延長，酶解產物的水解度逐步增大，當酶解時間為4 h時，無顯著增大（P＞0.05），同時DPPH自由基清除率也隨酶解時間的延長，逐步增大，水解5 h時，無顯著增大（P＞0.05），因此，綜合考慮水解度和DPPH自由基清除率，選擇酶解時間為3～4 h為宜。

2.2.3 酶添加量對酶解產物水解度和DPPH自由基清除率的影響

圖3 酶添加量對水解液水解度和DPPH自由基清除率的影響Fig. 3 Effect of enzyme dosage on DH and DPPH radical scavenging capacity

由圖3可知，酶解產物的水解度和DPPH自由基清除率均隨酶添加量的提高而逐漸增大，當酶添加量為3 000 U/g時，其水解度和DPPH自由基清除率分別為36.24%和42.41%，繼續增加酶量，兩者均無顯著增大（P＞0.05），故適宜的酶添加量為3 000 U/g左右。

2.3 響應面優化試驗結果

根據單因素試驗結果，以水解度和DPPH自由基清除率為響應值進行響應面優化試驗，試驗方案及結果如表2所示。

表2 響應面試驗設計與結果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

使用Design-Expert V 8.0.6軟件建立響應值對自變量編碼值的二次回歸模型方程：

為了檢驗模型的實際有效性，對結果進行方差分析與顯著性檢驗，結果見表3、4。通過表3分析可知，兩個模型的P＜0.000 1和P＝0.000 3，說明這兩個模型極顯著；失擬項的P＝0.243 2＞0.05和P＝0.081 5＞0.05，不顯著；對水解度和DPPH自由基清除率的回歸方程進行顯著性檢驗，發現兩個模型的相關系數分別為R2＝0.976 4＞0.95和R2＝0.963 9＞0.95，說明模型擬合程度較好；變異系數分別為0.18%和0.25%，可知兩個模型都能較好地反映真實試驗值。因此，可用這兩個模型對魷魚須脫皮液膠原蛋白酶的酶解效果進行預測。

分析這兩個模型各個系數的P值，發現因素A、C、AC、A2、B2對水解度的影響極顯著（P＜0.01），因素A、B、C、B2對DPPH自由基清除率的影響極顯著（P＜0.01）；因素BC、C2對水解度的影響顯著（P＜0.05），因素BC、A2對DPPH自由基清除率影響顯著（P＜0.05）。

表3 回歸模型的方差分析（水解度為響應值）Table 3 Analysis of variance of the regression model with DH as response value

表4 回歸模型的方差分析（DPPH自由基清除率為響應值）Table 4 Analysis of variance of the regression model with DPPH radical scavenging capacity as response value

通過Box-Behnken試驗回歸模型得到各響應面和等高線圖（圖4～6），圖中橢圓排列越稀疏，說明因素變化對結果影響越小，反之；響應面坡度越陡，說明響應值對工藝參數的變化越敏感，該參數對試驗結果的影響越大，反之；等高線的形狀可反映交互作用的強弱，橢圓表示兩因素交互作用顯著，圓形反之[32]。通過觀察圖4～6可知：交互項中底物蛋白質質量分數和酶添加量對水解度和DPPH自由基清除率的響應面坡度最陡，說明底物蛋白質質量分數和酶添加量對試驗結果的影響最大；底物蛋白質質量分數與酶解時間之間交互的等高線圖成圓形，說明底物蛋白質質量分數與酶解時間的交互作用可忽略。此結果與二次回歸方程得到的結果相一致。

結合模型和響應面曲線圖分析，得到魷魚須脫皮液膠原蛋白酶酶解較合適的工藝參數為：底物蛋白質質量分數3.125%、酶解時間3.735 h、酶添加量3 000 U/g，預測的水解度與DPPH自由基清除率分別為37.27%、43.64%，為了實際操作方便，選取底物蛋白質質量分數為3.2%、酶解時間3.7 h、酶添加量3 000 U/g，在此條件下，進行6次重復驗證性實驗，得到水解度與DPPH自由基清除率分別為（37.23±0.08）%、（43.61±0.09）%，與回歸方程所得的水解度與DPPH自由基清除率的相對誤差分別為0.11%和0.07%，以上驗證實驗可以說明通過響應面優化得到的最佳工藝參數可靠、有效，能較好預測魷魚須脫皮液酶解產物的水解度與DPPH自由基清除率。

圖4 底物蛋白質質量分數和酶解時間對水解度和DPPH自由基清除率影響的響應面與等高線圖Fig. 4 Response surface and contour plots for the effect of substrate protein concentration and hydrolysis time on hydrolysis degree and DPPH radical scavenging rate

圖5 底物蛋白質質量分數和酶添加量對水解度和DPPH自由基清除率影響的響應面與等高線圖Fig. 5 Response surface and contour plots for the effect of substrate protein concentration and enzyme dosage onhydrolysis degree and DPPH radical scavenging rate

圖6 酶解時間和酶添加量對水解度和DPPH自由基清除率影響的響應面與等高線圖Fig. 6 Response surface and contour plots for the effect of hydrolysis time and enzyme dosage on hydrolysis degree and DPPH radical scavenging rate

2.4 魷魚須脫皮液酶解產物抗氧化活性評價

圖7 魷魚須脫皮液酶解產物抗氧化活性Fig. 7 Antioxidant activities of squid tentacle peeling liquid

由圖7可知，隨著酶解產物質量濃度的增加，其抗氧化活性也逐漸升高，其中對ABTS+·與·OH均具有較強的清除能力，即IC50分別為0.37 mg/mL和0.41 mg/mL。Cai Luyun等[33]研究了草魚皮的3種抗氧化肽Pro-Tyr-Ser-Phe-Lys （640.74 D）、Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Leu（618.89 D）、Val-Gly-Gly-Arg-Pro （484.56 D）的ABTS+·清除率IC50值分別為0.18、0.33、0.47 mg/mL；王雨生等[34]研究了黃鰭金槍魚皮膠原肽的抗氧化活性，其·OH清除率的IC50為0.39 mg/mL，與之相比，本實驗膠原肽的ABTS+·與·OH清除率低于以上研究結果，有可能是因為本酶解產物是粗提物所致；當質量濃度為0.20 mg/mL時，膠原肽的OD700nm值為0.53，而賈建萍等[35]報道的三文魚皮，在質量濃度為2.5 mg/mL時，膠原肽的OD700nm值為0.41，由此可見，本魷魚須脫皮液膠原肽具有較好的抗氧化活性。

2.5 酶解產物分子質量分布

SDS-PAGE圖譜顯示（圖8a），在最適的酶解工藝下，蛋白條帶基本消失，說明魷魚須脫皮液中的蛋白質基本被水解成小分子多肽，證實此酶解工藝較好。為進一步分析酶解液多肽的分子質量分布，采用凝膠排阻色譜對酶解產物的分子質量分布進行分析，由圖8b可知，酶解產物的分子質量多集中在1～5 kD之間，占49.90%，進一步證明了SDS-PAGE圖譜的結果。

圖8 膠原肽的分子質量分布圖譜Fig. 8 Molecular weight distribution of collagen-derived peptides

3 結 論

為了解決企業在加工魷魚須過程中產生的脫皮液處理問題，對其進行有效開發利用，提高其附加值，節約資源，為魷魚資源深度開發及其下腳料的綜合利用提供實驗依據。本研究采用膠原蛋白酶對魷魚須脫皮液進行酶解，得到最適工藝為：酶解溫度50 ℃、底物蛋白質質量分數3.2%、酶解時間3.7 h、酶添加量3 000 U/g、初始pH 7.4，此時樣品的水解度與DPPH自由基清除率分別為（37.23±0.08）%和（43.61±0.09）%。抗氧化活性評價結果表明該酶解產物具有較強的ABTS+·清除率與·OH清除率，它們的IC50分別為0.37 mg/mL和0.41 mg/mL，且具有一定的亞鐵還原能力；SDS-PAGE顯示：最適酶解工藝下，魷魚須脫皮液中的蛋白質基本被水解成小分子多肽；凝膠過濾層分析可知：酶解產物的分子質量多集中在1～5 kD之間。因此，酶解產物具備較強的抗氧化活性，可作為抗氧化活性物質基料充分開發利用。

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Optimization of Enzymatic Hydrolysis of Collagen-Rich Waste Liquid from Squid Tentacle Peeling for Preparing Antioxidant Peptides Using Response Surface Methodology and Their Antioxidant Activities

LUO Chunyan1, WU Yangyang1, SUN Haiyan1,2, YU Hui1, JIANG Xuhua3, CHEN Xiaoe1,2,* (1. School of Food and Pharmacy, Zhejiang Ocean University, Zhoushan 316022, China; 2. Joint Key Laboratory of Zhejiang Province for the Research of Fishery Processing Technology, Zhoushan 316022, China; 3. Zhejiang Fudan Tourism Food Co. Ltd., Zhoushan 316104, China)

Objective: To investigate the optimum parameters for enzymatic hydrolysis of collagen-rich waste liquid from squid (Dosidicus gigas) tentacle peeling and evaluate the antioxidant activity of its hydrolysate. Methods: The hydrolysis parameters were optimized using one-factor-at-a-time method and response surface methodology based on 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging activity and degree of hydrolysis (DH). The antioxidant activity of hydrolysate was evaluated by using scavenging rate of 2,2’-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)diammonium salt radical (ABTS+·) and hydroxyl radical scavenging and ferric reducing/antioxidant power (FRAP) assays and the molecular weight distribution was analyzed by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and gel filtration chromatography. Results: The optimal hydrolysis parameters were determined as follows: hydrolysis temperature, 50 ℃; substrate (protein) content, 3.2%; hydrolysis time, 3.7 h; enzyme dosage, 3 000 U/g; and initial pH, 7.4, resulting in a DH value of (37.23 ± 0.08) % and a scavenging rate of DPPH radical of (43.61 ± 0.09) %, respectively. The half inhibitory concentrations for ABTS+· and hydroxyl radical scavenging ability (IC50) of the hydrolysate obtained were 0.37 and 0.41 mg/mL, respectively. Moreover, the product showed a strong reducing capacity. SDS-PAGE analysis showed that most collagens in the waste liquid were hydrolyzed into small peptides with molecular weight of 1-5 kD as determined by gelexclusion chromatography. Conclusion: The hydrolysate derived from waste liquid from squid tentacles peeling has strong antioxidant activity and could be used as a functional seafood condiment and nutritional supplement for further development and utilization.

waste liquid from squid tentacle peeling; enzymatic hydrolysis; antioxidant activity; degree of hydrolysis; half inhibitory concentration

10.7506/spkx1002-6630-201621030

TS254.4

A

1002-6630（2016）21-0176-07

羅春艷, 吳楊陽, 孫海燕, 等. 響應面優化魷魚須脫皮液膠原肽酶解工藝及抗氧化活性[J]. 食品科學, 2016, 37(21): 176-182. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201621030. http://www.spkx.net.cn

LUO Chunyan, WU Yangyang, SUN Haiyan, et al. Optimization of enzymatic hydrolysis of collagen-rich waste liquid from squid tentacle peeling for preparing antioxidant peptides using response surface methodology and their antioxidant activities[J]. Food Science, 2016, 37(21): 176-182. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201621030. http://www.spkx.net.cn

2016-01-07

浙江省科技計劃項目（2015C31106）；舟山市科技計劃項目（2016C41022）；國家級大學生創新創業訓練項目（201310340009）

羅春艷（1993—），女，碩士研究生，研究方向為食品加工與安全。E-mail：992351360@qq.com

*通信作者：陳小娥（1968—），女，教授，博士，研究方向為海洋資源綜合利用。E-mail：xiaoechen@163.com