氯吡脲人工抗原的合成與鑒定

肖石妹，鄢愛平，肖 芳，萬益群,，郭 嵐,,*

（1.南昌大學化學學院，江西 南昌 330031；2.南昌大學分析測試中心，江西 南昌 330047）

氯吡脲人工抗原的合成與鑒定

肖石妹1，鄢愛平2，肖 芳1，萬益群1,2，郭 嵐1,2,*

（1.南昌大學化學學院，江西 南昌 330031；2.南昌大學分析測試中心，江西 南昌 330047）

為合成新的、有效的氯吡脲（forchlorfenuron，CPPU）人工抗原，在無水三氯化鋁的催化作用下，采用傅克反應對CPPU小分子進行結構改造。采用碳二亞胺（carbodiimide，EDC）法將半抗原分別與牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）和卵清蛋白（ovalbumin，OVA）進行偶聯，獲得CPPU的免疫抗原（CPPU-BSA)和包被抗原（CPPU-OVA）。采用質譜、元素分析和核磁共振氫譜對CPPU半抗原（CPPU-COOH）的分子結構式進行鑒定；采用紫外光譜和高性能基質輔助激光解吸電離-飛行時間質譜對偶聯物的結構和相對分子質量進行鑒定。結果顯示成功合成出CPPU人工抗原，為其抗體的制備和免疫學方法的構建提供了參考。

氯吡脲；半抗原；人工抗原；合成；鑒定

氯吡脲（forchlorfenuron，CPPU）是一種高活性的植物生長調節劑[1]，具有加速細胞有絲分裂、促進細胞的增大和分化、防止落花落果、促進果實膨大等作用，常用于臍橙、柑橘、獼猴桃、葡萄、西瓜、黃瓜等果蔬的農業生產中。殘留于果蔬中的CPPU可能會對人類及其他生物造成潛在的威脅，美國環保署在《農藥毒性確認和管理》中指出，長期接觸CPPU會引起體內蛋白質代謝的紊亂，造成肺氣腫和體型消瘦。各國對食品中CPPU的最大殘留限量不同，范圍為0.01～0.1 mg/kg，如澳大利亞規定獼猴桃中CPPU的最大殘留限量為0.01 mg/kg，美國為0.04 mg/kg，歐盟為0.05 mg/kg，日本為0.1 mg/kg[2-3]。我國規定食品中CPPU最大殘留限量為黃瓜、西瓜、甜瓜不大于0.1 mg/kg，獼猴桃、葡萄、橙、枇杷不大于0.05 mg/kg[4]。因此，開展食品中CPPU殘留快速檢測新技術研究對食品安全生產、現場監督都有著十分重要的現實意義。

CPPU殘留檢測目前主要采用固相萃取-高效液相色譜[5]、液相色譜[6]、氣相色譜-質譜聯用[7]、液相色譜-質譜聯用[8]等技術，這些方法的準確度和精密度較高，但存在檢測成本高、周期長及操作繁瑣等缺陷，不適于大規模現場篩查。與色譜等分析技術相比，免疫分析法基于抗原與抗體特異性結合的測定原理，具有樣品前處理簡單、樣品用量少、檢測成本低、選擇性高及分析速度快等特點。該法已廣泛應用于食品中真菌毒素[9]、農藥[10-11]、獸藥[12]殘留等危害物的檢測，但目前鮮見其應用于食品中CPPU殘留分析的報道。

小分子物質只有反應原性，而不具備免疫原性[13]，要想獲得其抗體，構建免疫學分析方法，必須首先與大分子蛋白載體偶聯合成全抗原，這要求小分子化合物本身具有或者通過衍生得到活性基團（如氨基、羧基、重氮鹽等）才能與載體進行交聯反應[14-15]。CPPU本身無活性基團，因此，本研究采用傅克反應在CPPU的苯環上引入活性基團羧基鏈，然后與載體蛋白交聯成功制備CPPU的人工抗原。本研究合成方法簡單、有效，拓寬了可選用的抗原合成方法，為CPPU抗體的進一步制備提供了前期研究基礎。

1 材料與方法

1.1 試劑

CPPU（純度≥98%）、丁二酸酐 上海百靈威公司；N-羥基琥珀酰亞胺（N-hydroxysuccinimide，NHS）、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride，EDC）、N,N-二甲基甲酰胺（N,N-dimethyllformamide，DMF，分析純）、無水三氯化鋁、鹽酸 上海生工生物工程股份有限公司；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、卵清蛋白（ovalbumin，OVA） 美國Sigma公司；1×PBS透析液（0.01 mol/L，pH 7.4）：NaCl 8 g，KCl 0.2 g，KH2PO40.2 g，Na2HPO4·12H2O 2.9 g，蒸餾水定容至1 000 mL；甲醇、乙腈（色譜純，99.9%） 美國Tedia公司；芥子酸（4-hydroxy-3,5-dimethoxycinnamic acid，TFA） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；其余試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

AV 600核磁共振波譜儀 瑞士布魯克公司；5800基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜儀 美國AB Sciex公司；6430三重串聯四極桿液質聯用儀 美國Agilent公司；EL Ⅲ元素分析儀 德國Elementar公司；MX5微量天平 瑞士Mettler Toledo公司；2501PC紫外-可見分光光度計 日本島津公司；搖床 上海智誠電子有限公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鞏義市予華儀器有限責任公司；SM2渦旋混合器 德國IKA公司；Milli-Q超純水儀 美國Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 CPPU半抗原的制備

采用傅克反應[16-17]合成CPPU半抗原（CPPU-COOH）。采用無水DMF做溶劑，CPPU（2.48 g）、丁二酸酐（1 g）、無水三氯化鋁（13.35 g）按1∶1∶10的物質的量比進行投料。將DMF（2.2 mL）逐滴加入到裝有無水三氯化鋁的燒瓶中，不斷攪拌使其充分溶解，待瓶口不再有白霧冒出時放入油浴中。把CPPU和丁二酸酐的混合物加入到燒瓶中，反應2 h后，把反應液慢慢倒入90 mL冰水中，加6 mL濃度為12 mol/L的濃鹽酸，冷卻靜置后過濾水洗，得到粗品，再用DMF/甲醇對粗品進行重結晶純化，得到淡粉色固體物質。其合成路線見圖1。

圖1 CPPU半抗原合成路線Fig. 1 Synthetic route of CPPU-COOH

1.3.2 CPPU半抗原的結構鑒定

1.3.2.1 元素分析儀對半抗原的最簡式鑒定

采用元素分析儀對純化后的CPPU-COOH進行分析測定。C、H、N 3 種元素的測定用對氨基苯磺酸作為標準品校準儀器，然后再稱取5 mg樣品置于還原管和燃燒管中燃燒，同時通氦氣（He）和氧氣（O2），He流量為200 mL/min，O2流量為25 mL/min；O元素的測定用苯甲酸作為標準品校準儀器，然后再稱取1.5 mg樣品置于燃燒管中燃燒，只通O2，流量為200 mL/min。

1.3.2.2 液相色譜-質譜聯用儀對半抗原的相對分子質量鑒定

采用三重串聯四極桿液相色譜-質譜聯用儀對純化后的CPPU-COOH的分子式進行分析。色譜柱為Eclipse XDB-C18Column（4.6 mm×50 mm，1.8 μm）；流動相為100%的色譜純甲醇；流速為0.3 mL/min；進樣量為5 μL；設定掃描范圍為m/z 50～500；霧化氣壓力為40 psi；干燥氣流速為11.0 L/ min；干燥氣溫度為300 ℃；毛細管電壓為4.0 kV。在電噴霧離子源（electron spray ionization，ESI）離子源的正負離子模式下同時檢測，再以分子離子為母離子做二級質譜正負離子掃描。

1.3.2.3 核磁共振對半抗原的分子結構式鑒定

結合核磁共振對CPPU原料和CPPU-COOH的氫原子進行氫譜鑒定。稱取5 mg樣品置于核磁管中，用氘代試劑二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）充分溶解樣品，再對充分溶解的樣品進行掃描，樣品測定前的等待時間為1 s，采集時間為3.1 s，每個樣品的掃描次數為16 次。

1.3.3 EDC法制備人工抗原

1.3.3.1 EDC法制備免疫抗原

[18]的方法，準確稱取CPPU-COOH 3.48 mg溶于200 μL DMF中，加入NHS 1.38 mg（另溶于200 μL DMF），再加入2.88 mg溶解好的EDC（另溶于300 μL DMF），室溫條件下振蕩反應12 h（溶液1）；稱取6.8 mg BSA（CPPU-COOH與BSA的物質的量比為100∶1）溶于2 mL 1×PBS中（溶液2）。再將溶液1逐滴加入溶液2中，邊加邊振蕩，冰浴振蕩反應12 h。反應混合物移入處理好的透析袋中，用超純水透析3 d，每天換3 次透析液，即得到CPPU免疫抗原（CPPU-BSA），合成路線見圖2。

圖2 CPPU免疫抗原的EDC法合成路線Fig. 2 Synthetic route of immunogen by EDC method

1.3.3.2 EDC法制備包被抗原

參考文獻[19]的方法，稱取CPPU-COOH 3.48 mg溶于200 μL DMF中，加入NHS 3.45 mg（溶于200 μL DMF），再直接加入2.88 mg EDC（另溶于300 μL DMF），室溫振蕩反應12 h（溶液3）；稱取4.5 mg OVA（CPPU-COOH與OVA的物質的量比為100∶1）溶于1.8 mL 1×PBS中（溶液4）。溶液3與溶液4混勻后，冰浴振蕩反應12 h。同上透析即得到CPPU免疫抗原（CPPU-OVA），合成路線同圖2。

1.3.4 CPPU人工抗原的鑒定

1.3.4.1 紫外光譜分析

將半抗原（CPPU-COOH）、全抗原（CPPU-OVA，CPPU-BSA）和載體蛋白（BSA、OVA）分別用超純水稀釋至質量濃度范圍在0.01～0.1 mg/mL之間，使得物質的吸光度在0.2～0.8之間，用超純水做參比溶液，測定物質的吸光度[20-21]。

1.3.4.2 高性能基質輔助激光解吸電離-飛行時間質譜（matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）分析

基質輔助溶液的配制[22]：將34 μL 0.15% TFA與17 μL的乙腈混合，再加入適量的TFA使溶液達到過飽和狀態，超聲20 min，3 000 r/min 離心5 min，取上清液備用。

載體蛋白BSA、OVA以及偶聯物CPPU-BSA、CPPU-OVA脫鹽后分別與基質輔助溶液混合，點到樣品靶上，放入質譜儀內進行激光掃描。通過相對分子質量數據的改變說明半抗原與蛋白偶聯成功與否，并計算出蛋白與半抗原的偶聯比[23]，CPPU與載體蛋白的結合比按以下公式計算。

式中：MA、MB和MC分別表示半抗原、載體蛋白、全抗原的相對分子質量。

2 結果與分析

2.1 CPPU半抗原的分子結構式鑒定

2.1.1 元素分析儀對半抗原的測定結果

采用元素分析儀對半抗原合成產物的C、H、O、N 4種元素的含量進行測定，Cl的含量通過差減法求得。通過各個元素的百分含量推測物質的最簡式（表1）。由表中數據可知合成產物與目標化合物（C16H14ClN3O4）具有相同的最簡式。

表1 元素分析數據Table 1 Elemental analysis of the hapten

2.1.2 CPPU-COOH的質譜鑒定

圖3 CPPU半抗原的一級和二級質譜圖Fig. 3 Mass spectrum and tandem mass spectrum of CPPU-COOH

對合成的半抗原進行質譜鑒定，一級質譜ESI+下出現m/z 348.1離子（圖3a），ESI-下出現m/z 346.1離子（圖3b），分別對應于加合質子準分子離子峰[M+H]+和[M-H]-，可以判斷該物質的相對分子質量為347.1，與目標產物的理論相對分子質量（347.6）基本相符，這進一步驗證了元素分析的結果，說明合成產物與目標產物不僅具有相同的最簡式，而且相對分子質量也基本相同。再對照目標化合物的分子結構式，對合成產物的一級質譜及二級質譜出現的碎片離子做歸屬分析：一級質譜ESI-下出現的m/z 192.1（圖3b）為目標化合物斷裂酰胺鍵之后形成的N-（C6H4）（COC2H4COOH）碎片；二級質譜ESI+-MS2出現的m/z 128.9（圖3c）為斷裂酰胺鍵之后形成的NH2+（C5H3NCl）碎片；二級質譜ESI+-MS2出現m/z 126.9（圖3d）為斷裂酰胺鍵之后形成的N-（C5H3NCl）碎片。

2.1.3 核磁共振氫譜分析

為了進一步鑒定合成產物的分子結構式，對CPPU及純化后的CPPU-COOH分別進行1H-NMR（600 MHz，DMSO）分析。由圖4、5可知，CPPU共有10 個H，分別對應δ 9.179～9.405（2H，2NH）、δ 7.107～7.320（5H，苯環）、δ 7.436～8.209（3H，雜芳環）。而CPPU-COOH有14 個H，分別對應δ 9.389～9.469（2H，2NH）、δ 7.349～7.668（4H，苯環）、δ 7.967～8.212（3H，雜芳環）、δ 12.097（1H，COOH）、δ 2.573～3.334（4H，2CH2），其中苯環上有4 個H，分為兩類，分別對應δ 7.362（1.84H）、δ 7.668（1.86H）。將兩個核磁共振氫譜進行對照，可以清楚地看到，CPPU-COOH的1H-NMR譜圖中保留了CPPU中苯環、酰胺基和氮雜環的氫譜信息，增加了δ 12.097（1H，COOH）峰和δ 2.573～3.334（4H，CH2CH2）峰，同時苯環上的H由5 個變成4 個，并且只分為兩類，這說明在苯環上發生對位的單取代反應。由此可推測丁二酸酐開環與CPPU發生了苯環上的對位取代反應，形成一個含4 個C原子的取代基，同時末端的羰基轉變成了羧基，為新化合物與蛋白質偶聯創造了條件。

圖5 CPPU-COOH的核磁共振圖譜Fig. 51H-NMR spectrum of CPPU-COOH

由上述元素分析、質譜和核磁共振氫譜等技術手段的分析結果，可推斷所合成的產物即為實驗設計的CPPU-COOH目標物，該化合物保留了CPPU中苯環、雜環此類具有高免疫活性的特征結構[24]，同時引入了一個含3 個C原子的連接臂和羧基活性基團，便于與載體蛋白偶聯合成抗原，而合適的連接臂（3～6 個碳原子）的存在可以突出待測物分子的特征結構，使其不會被載體蛋白的三維結構掩蓋，從而保證免疫抗體的合成成功[25-26]。

2.2 CPPU人工抗原的鑒定

2.2.1 紫外掃描光譜分析

圖6 人工免疫抗原紫外掃描光譜圖Fig. 6 UV absorption spectrum of artificial immune antigen

按1.3.3節將CPPU-COOH分別與BSA和OVA進行偶聯得到人工免疫抗原和人工包被原，對人工抗原、半抗原和載體蛋白分別進行紫外光譜掃描，結果見圖6和圖7。由圖6可知，BSA在波長278 nm處有最大吸收峰，CPPUCOOH在298 nm波長處有最大吸收峰，而CPPU全抗原在309 nm波長處有最大吸收峰，說明產物與兩種反應物相比，最大吸收峰位發生了一定的變化，表明CPPU-COOH與BSA可能發生了偶聯反應。同樣，由圖7可知，OVA與也可能發生了偶聯反應。

圖7 人工包被抗原紫外掃描光譜圖Fig. 7 UV absorption spectrum of artificial coating antigen

2.2.2 MALDI-TOF-MS測定全抗原和載體蛋白的相對分子質量

當載體蛋白偶聯上半抗原分子后，其分子質量會發生改變，因此可通過MALDI-TOF-MS測定蛋白的相對分子質量（圖8），來進一步驗證載體蛋白是否與半抗原發生偶聯，同時測定偶聯比。

圖8 載體蛋白和人工抗原的質譜圖Fig. 8 Mass spectra of carrier proteins and artificial antigens

由MALDI-TOF-MS測定結果可知，載體蛋白BSA的單電荷離子峰為66 276.241（圖8a），OVA的單電荷離子峰為44 425.687（圖8b），全抗原CPPU-BSA的分子離子峰為74 874.767（圖8c），CPPU-OVA的分子離子峰為47 382.236（圖8d），這些數據很好地說明了半抗原小分子成功地與載體蛋白進行了偶聯[27]。已知CPPU-COOH相對分子質量是347，可得出平均每個載體蛋白BSA分子上偶聯的CPPU-COOH分子個數＝（74 874.767-66 276.241）/347≈24.78 個。載體蛋白OVA分子上偶聯的CPPU-COOH分子個數＝（47 382.236-44 425.687）/347≈8.52 個。為獲得相應的抗血清，合成的人工抗原一般要求小分子與載體蛋白的偶聯比在1∶10～1∶25之間，方可有效地刺激機體產生免疫應答[28]，另有文獻報道每一載體上含有8～25 個半抗原能得到效價較高的抗體[29]。因此從偶聯比結果來看，用本研究制備的CPPU免疫抗原（CPPU-BSA）免疫小鼠，有可能產生相應的應答。

3 結 論

本研究以CPPU和丁二酸酐為反應物，采用傅克反應制備CPPU-COOH，成功地在CPPU的苯環上引入一個含3 個碳原子的連接臂和活性基團羧基，既保留了CPPU的特征結構，又能夠與載體蛋白偶聯合成抗原，同時合適的連接臂可以很好地使小分子半抗原充分暴露在載體蛋白的表面，便于抗原遞呈細胞對其的識別，產生免疫應答[26]。采用重結晶法對合成的CPPU-COOH進行了純化，以避免雜質與載體蛋白偶聯而影響免疫效果。在此基礎上，采用EDC法制備了CPPU的免疫抗原及包被抗原。應用紫外光譜、質譜、核磁共振、元素分析等技術，對所制備的CPPU-COOH及其全抗原進行了結構鑒定。同時采用MALDI-TOF-MS分析技術，測得免疫原和包被原的偶聯比分別為24.78∶1和8.52∶1，表明成功合成了CPPU人工抗原，為其抗體的制備和免疫法的構建提供了依據。

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Synthesis and Identification of Artificial Antigens of Forchlorfenuron

XIAO Shimei1, YAN Aiping2, XIAO Fang1, WAN Yiqun1,2, GUO Lan1,2,*
(1. College of Chemistry, Nanchang University, Nanchang 330031, China; 2. Center of Analysis and Testing, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

This work aimed to develop an effective novel method to synthesize artificial antigens of forchlorfenuron (CPPU). Towards this goal, Friedel-Crafts reaction was used to modify the structure of forchlorfenuron with the catalysis of anhydrous aluminum chloride and the hapten was coupled with bovine serum albumin (BSA) and ovalbumin (OVA) by carbondiimine (EDC) method, respectively, to obtain forchlorfenuron immunogen and coating antigen. The molecular structure of the forchlorfenuron hapten was identified by elemental analysis, mass spectroscopy (MS) and nuclear magnetic resonance spectroscopy (1H-NMR). The artificial antigens were identified by UV spectroscopy and high performance matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectroscopy (MALDI-TOF-MS). The experimental results showed that the artificial antigen of forchlorfenuron has been synthesized successfully and it can lay the foundation for the preparation of antibody and the development of immunoassays.

forchlorfenuron; hapten; artificial antigen; synthesis; identification

10.7506/spkx1002-6630-201621031

TS201.2

A

1002-6630（2016）21-0183-06

肖石妹, 鄢愛平, 肖芳, 等. 氯吡脲人工抗原的合成與鑒定[J]. 食品科學, 2016, 37(21): 183-188. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201621031. http://www.spkx.net.cn

XIAO Shimei, YAN Aiping, XIAO Fang, et al. Synthesis and identification of artificial antigens of forchlorfenuron[J]. Food Science, 2016, 37(21): 183-188. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201621031. http://www.spkx.net.cn

2016-01-31

江西省科技支撐計劃重大項目（20143ACG70005；20133ACG70002）；國家自然科學基金地區科學基金項目（21465017）

肖石妹（1990—），女，碩士研究生，研究方向為食品質量與安全。E-mail：1959499683@qq.com

*通信作者：郭嵐（1973—），女，研究員，博士，研究方向為食品質量與安全。E-mail：guolan@ncu.edu.cn