重組蛋白表達技術的研究進展

蘇鵬，龔國利*

（陜西科技大學食品與生物工程學院，陜西西安710021）

重組蛋白表達技術的研究進展

蘇鵬，龔國利*

（陜西科技大學食品與生物工程學院，陜西西安710021）

當前用于藥物生產的分子主要為蛋白小分子，大量的高純度蛋白無法直接獲得，而重組蛋白技術能解決這一難題。該文綜述了真核、原核、無細胞以及其他蛋白表達系統在重組蛋白表達方面的研究進展，對于探索選擇合適的重組蛋白表達系統以及未來藥物研發具有重要意義。

重組蛋白；大腸桿菌；真核表達；研究進展

隨著遺傳學、基因組學以及蛋白組學的發展，重組功能性蛋白的市場需求急劇加大，而其首要條件是獲得大量高度純化且正確折疊的蛋白質[1]，以便后續對其結構、功能及相互作用進行系統分析，實現功能性蛋白產品的商業化。然而從原始有機來源或化學合成方法獲得大量高純度蛋白幾乎不可能，并且蛋白來源成分復雜、理化性質各異、結構功能多樣，蛋白質的純化一直是結構蛋白質組學研究與生物技術產品開發中的一個瓶頸問題，嚴重制約了后續功能蛋白質的產品化，因此重組蛋白技術不可或缺。本文對一些常見的外源基因表達系統（包括原核表達系統、真核表達系統、無細胞表達系統以及其他表達系統）進行了綜述，對每個表達系統自身的優勢進行總結，以期在對何選擇表達系統以及提高蛋白表達量上有所突破。

1　原核表達系統

1.1大腸桿菌表達系統

外源蛋白在原核宿主內重組表達時，轉錄后修飾缺乏糖基化和磷酸化作用（見表1），并且原核細胞質不是形成復雜二硫鍵的合適場所，導致外源蛋白在原核細胞質中的表達尤為困難。然而，大腸桿菌（Escherichia cole）遺傳背景清楚、繁殖快、成本低、表達量高、2H/13C/15N同位素標記技術穩定以及適用范圍廣等優點，外源蛋白的表達依然使用。近年來市售的大約30%的重組蛋白產品是由大腸桿菌生產[2]。當蛋白分子質量＜100 ku，翻譯后修飾作用不影響特定結構和生物活性時，大腸桿菌表達系統是首要選擇。但利用大腸桿菌表達系統生產藥用蛋白時，存在外源蛋白表達水平低、易形成不溶性包涵體以及表達易泄露等缺點，針對這些問題采取相應措施可優化其表達系統。

表1　外源蛋白表達系統的差異Table 1　Difference of heterologous protein expression systems

一方面，可根據宿主偏愛性優化互補脫氧核糖核酸（complementary deoxyribonucleic acid，cDNA）密碼子及互聯網程序已開發出來協助密碼子優化、采用能為目標基因提供稀有密碼子并可共表達的大腸桿菌、將pCold載體與增溶標簽融合，找到使pCold系統作用最大化的增溶標簽或將蛋白融合[3]和純化的“融合標簽”措施均可提高外源蛋白表達水平[4-6]方面，如果外源蛋白易形成不可溶的聚集物，溫度調節為20～30℃或采取低營養物質能使基因的轉錄翻譯被減弱，靶標蛋白適當折疊，溶解性提高[7]，可降低不溶性包涵體形成；此外，抑制泄露表達也對其有利，如當質粒轉化大腸桿菌時，往培養基中添加葡萄糖0.5%～1.0%，T7 RNA聚合酶泄漏表達可被抑制，質粒的穩定性提高；另一種方法是通過與T7溶菌酶共表達抑制T7RNA聚合酶泄漏活性，T7溶菌酶是T7RNA聚合酶天然抑制劑。大腸桿菌（Escherichia coli）宿主菌株與葡萄糖誘導性代謝物阻遏劑的聯合使用可有效表達目標蛋白、質粒的低拷貝數等都是抑制泄露表達的好方法。

除此之外，單一蛋白生產技術、自動誘導、高細胞密度培養、流加培養等方法在提高原核系統表達外源蛋白上也有不可忽略的作用。

1.2乳酸乳球菌表達系統

乳酸菌是革蘭氏陽性菌，膜單一，在大量膜蛋白的表達方面提供了革蘭氏陰性菌無法比擬的優勢，原因是革蘭氏陰性菌具有內外膜并覆蓋著厚厚的、剛性的肽聚糖層的內表面周質空間[8]，影響蛋白質的表達，而蛋白在乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）中的表達是通過融合Mistic到目標膜蛋白而加以改善[9]，提高其表達量。

1.3芽孢桿菌表達系統

芽孢桿菌（Bacillus）也屬于革蘭氏陽性菌。橋石短芽孢桿菌（Brevibacillus choshinensis）和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）表達系統由Takara、MoBiTec公司開發與提供。芽孢桿菌能過表達并且能分泌外源蛋白到培養基中，這適合分泌型蛋白的生產，如細胞因子或需要形成復雜二硫鍵的外源蛋白。這個系統也被用來生產2H/13C/15N同位素標記的外源蛋白，用于溶液核磁共振研究[10]。

2　真核表達系統

2.1酵母表達系統

酵母是一種真核微生物，其細胞有表達外源蛋白的能力，可以達到一個相當高的胞密度狀態，在酵母中表達外源蛋白可以進行翻譯后修飾，如磷酸化和糖基化。由于酵母宿主細胞結合了細菌和高階生物宿主細胞表達系統的優良特性，當外源蛋白未能成功地在大腸桿菌中表達時，它是一個不錯的選擇（見表1）。酵母能在pH值為4～7的范圍內生存，但不能在易導致蛋白質變性或聚集的pH值條件下分泌外源蛋白。充足的碳源和通氣是酵母細胞生長和蛋白表達的關鍵[11]，能實現高速攪拌和連續供氣效率的最大化，但攪拌產生的氣泡會破壞宿主細胞，所以消泡劑的添加必不可少。

用于外源蛋白表達的酵母菌株包括釀酒酵母（Schizosaccharomyces pombe）、粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）、畢赤酵母（Pichia pastoris）和乳酸克魯維酵母（Kluyveromyces lactis）。甲基營養型畢赤酵母可增強AOX啟動子活性，當一個興趣基因位于AOX啟動子下游時，可以在培養基中加入甲醇誘導外源蛋白的表達[12]。利用乳酸克魯維酵母來表達外源蛋白時，可被LAC4啟動子調控，LAC4啟動子可通過在培養基添加半乳糖來激活。因此，培養基中的半乳糖作為碳源來培養轉化株，外源蛋白的表達和細胞生長同步進行。人血清白蛋白（human serum albumin，HSA），麥芽糖結合蛋白（maltose-binding protein，MBP），谷胱甘肽-S-轉移酶（glutathione S-transferase，GST）和小泛素相關修飾蛋白（small ubiquitin modifier，SUMO）被用作酵母表達系統的融合標簽[13]。缺少半胱氨酸殘基的MBP可以用作增溶標簽在細胞質或分泌物間協調表達。采用畢赤酵母和乳酸克魯維酵母作為異源表達的2H/13C/15N同位素標記技術已被開發[14]。

2.2昆蟲細胞表達系統

膜蛋白、大分子質量蛋白和蛋白激酶這些很難用細菌表達系統表達的蛋白，在Sf9或High-5等昆蟲細胞中實現了表達[15]。

在大多數昆蟲細胞表達系統中，外源基因通過桿狀病毒載體轉染宿主細胞，含有目標基因的標記盒通過同源重組并入宿主基因組中（表1）。為構建桿狀病毒載體，市面上提供了Bac-to-Bac，baculogold，bacpak和bacmagic等，將目的基因或不同基因的多拷貝整合到宿主基因能實現對多個靶蛋白實現共表達[16]。最近的MultiBac系統實現了在昆蟲宿主細胞內協助多蛋白復合物的表達[17]。用于昆蟲細胞表達系統的增溶標簽包括GST和SUMO，外源蛋白的2H/13C/15N同位素標記也可使用昆蟲宿主細胞[18]。

2.3哺乳動物細胞表達系統

高創造性思維是觀念、思維、聯想、表達、變通能力的體現。本研究顯示，艦艇軍人高創造性思維水平人數占15.8%，一般創造性思維水平占84.2%，符合常態分布。流暢力、開放力、變通力、獨創力及標題5個維度A、C組差異有統計學意義。 C組不成熟防御方式平均分顯著高于A組，成熟防御方式平均分顯著低于A組，這提示高創造性思維水平更多的使用成熟的防御方式，在應用不成熟的防御方式人群中其創造性思維水平低于應用成熟防御方式。

當含有復雜二硫鍵或翻譯后修飾的靶蛋白不能使用其他表達系統表達時，哺乳動物細胞可表達外源蛋白（表1）。常用的外源蛋白表達的哺乳動物細胞系包括海拉（Hela）細胞、人胚腎細胞（HEK293）和中國倉鼠卵巢細胞（CHO）。哺乳動物細胞的各種異源基因轉染方法總結見表2[19]。外源蛋白的成功生產，重要的是選擇合適的轉染方法。如果興趣蛋白通過與其他分子或翻譯后修飾形成的配合物證實有生物活性是形成分子復合物所需的，則復合物可以純化。這些復合物也可以用昆蟲宿主細胞產生。復雜分子的三維結構可以通過X射線晶體學或電子的微觀結構分析。然而有時候消除在處理糖基化酶時可能在分子配合物中出現的糖鏈是更可取的，這是由于異源糖鏈可以干擾結晶或后續的結構分析[20]。與其他系統相比哺乳動物宿主細胞的缺點包括外源蛋白表達能力較差、成本高，尤其是產生2H/13C/15N同位素標記的外源蛋白。

表2　哺乳動物細胞的異源基因轉染方法的特點Table 2　Characteristics of heterologous gene transfection methods of mammalian cells

增溶標簽已被用于哺乳動物宿主細胞的外源蛋白表達，包括GST，SUMO和鹵代烷脫鹵素酶（HaloTag）[21]。外源蛋白的硒代蛋氨酸標記和同位素標記可分別用于哺乳動物細胞表達系統的結晶相和核磁共振測量[22]。

3　無細胞表達系統

在無細胞蛋白的合成中，通過混合cDNA或信使核糖核酸（messenger ribonucleic acid，mRNA）編碼靶蛋白和細胞提取物（含有核糖體和其他蛋白質生物合成所需的分子體系）實現目標多肽在試管中翻譯，提取物來源于大腸桿菌、小麥胚芽、昆蟲細胞和哺乳動物細胞（來自兔子鐮狀紅細胞或CHO細胞）。主流的無細胞（cell free，CF）表達策略為分層、分批提供新鮮組分到混合物中，消除混合物中副產物。在分批處理時，mRNA編碼的蛋白連續注入反應物中，這可以提高產量，特別是當反應時間長、反應規模大時，并且存在裂解液中核糖核酸酶使靶標mRNA降解可能性增加。

無細胞蛋白合成系統能夠表達其他表達系統很難表達的蛋白，如毒性蛋白、膜整合蛋白、生物活性肽，并有一些優點：1）共表達的蛋白復合物明確；2）高通量特性；3）全自動化[23]。此外，能更好的生產需要二硫鍵形成的外源蛋白，因為裂解物的氧化還原條件可使用添加劑或改變還原劑/氧化劑的比例進行調節[24]。用于CF反應的大腸桿菌裂解物組分可以根據單系統的實驗目的設計[25]。

CF表達系統可將化學修飾的氨基酸整合到蛋白質所需的位置，因為它具有簡潔的基因翻譯工具和代謝穩定的特點[26]。蛋白表達過程中增加轉氨酶和氨基酸合成酶抑制劑或硼氫化鈉（NaBH4）抑制其不規則性[27]。2H/13C/15N同位素標記的氨基酸樣品可以使用CF表達系統制備。此外，一種新的氨基酸和特定同位素標記技術已被MIYANOIRI Y等[28]發展，這種技術被稱為立體陣列同位素標記（stereo array isotope labeling，SAIL）。用SAIL技術，先前分子質量限制不能進行的蛋白質核磁共振研究現在已經得到認可，同時該方法可得到簡化光譜，增加了核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）信號的敏感性[28]。

CF表達系統適用于膜蛋白的生產，溶解的膜蛋白在含有洗滌劑的CF反應混合物中的表達可以重組到脂質雙分子層中如脂質體、雙層細胞和奈米圓盤[29]。在這個過程中，在附帶脂質清潔劑交換程序下，自發的共轉化和翻譯后修飾方法被使用。CF表達系統的易操作和高通量特性，能夠用于膜蛋白最佳增溶條件的篩選[30]，缺點是不適合大量蛋白質的生產，因為蛋白表達水平比活宿主細胞的低，成本昂貴。

4　其他蛋白質表達系統

植物細胞表達系統已被開發，利用煙草BY-2來作為宿主細胞，可生產出13C/15N同位素標記的外源蛋白，還可通過溶液NMR法成功地測定蛋白質的三級結構[31]。此外，幾種不同的重組蛋白表達系統也相繼被開發，如原生動物或真菌重組蛋白表達系統[32]。

5　總結與展望

綜上所述，獲得具有天然結構和足夠多的生物功能的蛋白質，以及發現新型蛋白分子對于實現藥物發現新突破尤為重要。重組蛋白技術使蛋白分子功能得以改善，蛋白純度有效提高。原核表達系統、真核表達系統、無細胞表達系統以及其他蛋白生產方法的應用，雖然尚存缺點，但其獨有的優勢應該加以利用。另外同位素標記技術以及核磁共振技術的結合，使活細胞分子以及蛋白結構測定的生物學分析邁上新臺階，這將更有利于藥物研發[33]。目前重組蛋白的表達和純化技術仍然需要克服困難并在研究過程中積累經驗，及時汲取相關領域的研究進展，找出重組蛋白的制約因素，對癥下藥。隨著基因工程技術以及蛋白質組學的發展，重組蛋白技術將會越來越成熟，作為藥物分子的靶標蛋白將會有新的突破。

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Research progress on the recombinant protein expression technology

SU Peng,GONG Guoli*
(School of Food and Biological Engineering,Shaanxi University of Science&Technology,Xi'an 710021,China)

At present,the molecules used in drug production are mainly small molecules.A large amount of proteins with high purity cannot be obtained directly,but the recombinant protein technology can solve this problem.The research progress of eukaryon,protokaryon,acellular and other protein expression system in the recombinant protein expression was summarized,which had important significance for choosing the appropriate expression system to express proteins and development of drugs in the future.

recombinant protein;Escherichia coli;eukaryotic expression;research progress

Q786

0254-5071（2016）10-0009-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.10.003

2016-06-17

國家自然科學基金項目（20906085）；陜西科技大學學術骨干培育計劃項目（XSG2010009）

蘇鵬（1991-），男，碩士研究生，研究方向為中藥生物技術。

龔國利（1976-），男，教授，博士，研究方向為食品微生物技術。