濃香型白酒窖泥鈣化成因及緩解措施的初步探究

陳彬，閆寅卓*，王德良，陳翔

（1.中國食品發酵工業研究院，北京100015；2.江蘇洋河酒廠股份有限公司，江蘇宿遷223800）

濃香型白酒窖泥鈣化成因及緩解措施的初步探究

陳彬1，閆寅卓1*，王德良1，陳翔2

（1.中國食品發酵工業研究院，北京100015；2.江蘇洋河酒廠股份有限公司，江蘇宿遷223800）

窖泥對于濃香型白酒的品質起著重要的作用，而目前各大酒廠窖池中的窖泥卻頻頻出現鈣化問題，直接影響了白酒的酒質。該研究通過對鈣化窖泥和優質老窖泥在理化指標方面進行對比，得出窖泥鈣化的主要原因是：由于窖泥中水分降低、pH降低等因素，導致窖泥中形成乳酸鈣、乳酸鐵等白色晶體，使得窖泥板結、出現白斑，質量下降。鑒于此，該研究采取在窖泥中加入產堿桿菌（Alcaligenessp.）、酒花酸浸提液和乳酸鏈球菌肽（Nisin）3種措施，以此來緩解窖泥的鈣化問題。結果表明，發現3種措施均能夠緩解窖泥的鈣化，且3種措施緩解的側重點不同，綜合分析后發現加入Nisin的效果最佳。

窖泥；鈣化；原因；緩解措施

眾所周知，生產濃香型酒，窖泥是基礎，大曲是動力，工藝是關鍵[1]。好酒源自好窖，便是這個道理[2]。優質的窖泥被稱為“泥巴國寶”、“黃金微生物”等，其一直吸引著眾多學者的高度關注[3]。窖泥中棲息著大量的微生物，這些微生物錯綜復雜，其中對于濃香型白酒產生重要影響的己酸菌、乳酸菌、乙酸菌、甲烷菌等，特別是己酸菌[5-6]。因此窖泥質量的好壞，直接影響著其內部的菌系結構，并對酒質造成較大影響[7]。

由于種種因素，窖泥在使用幾年后會出現不同程度的退化現象，窖泥逐漸鹽堿化、僵硬，窖壁表面及窖底析出淺白色顆粒或針狀結晶物質，即窖泥的“鈣化”現象[8-9]。這嚴重影響了窖泥中的微生物菌系，特別是己酸菌的生長。目前國內主要通過變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）技術對窖泥中的微生物組成、結構，進行分析研究[10-12]，而國外幾乎沒有對其研究。而對于鈣化的定義以及鈣化窖泥對酒質的影響，還未見詳盡的報道與總結；因此分析鈣化窖泥中的成分以及如何解決鈣化現象，將是研究窖泥的主體方向。

本實驗通過對鈣化窖泥和優質窖泥的理化成分進行分析研究，并進行了窖泥鈣化緩解措施的初步探究，該研究系統揭示了窖泥鈣化形成因素，為行業中緩解窖泥鈣化提供了技術和理論上的支持。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

窖泥：江蘇洋河酒廠股份有限公司（洋河酒廠、雙溝酒廠）；產堿菌（Alcaligenessp.）：中國工業微生物菌種保藏中心；乳酸、乙酸、甲酸、丙酮酸、戊酸、己酸（均為色譜純）：賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

酒花酸浸提液：巴特哈斯（北京）貿易有限公司；Nisin：天津艾瑪斯特生物科技有限公司。

1.2儀器與設備

Multiwave 3000安東帕微波消解儀：奧地利安東帕（中國）有限公司；DNP-9162電熱恒溫培養箱：上海精宏實驗設備有限公司；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器：上海博訊實業有限公司醫療設備廠；NexION 350電感耦合等離子體質譜儀：珀金埃爾默企業管理（上海）有限公司；ISC3000離子色譜儀：美國DIONEX公司；Autosystem XV氣相色譜儀：美國PerkinElmer公司；PHS-3C pH計：上海儀電科學儀器股份公司。

1.3實驗方法

1.3.1窖泥水分、pH和氧化還原電位的測定

取窖泥10 g（精確至0.001 g），在105℃烘箱內烘3 h，取出后，迅速移入干燥器內冷卻0.5 h，稱量。再放入電熱干燥箱內，繼續烘干1 h，冷卻稱量，直至恒質量，以此來計算窖泥水分含量；取窖泥10 g，溶解在100 mL超純水中，過濾后，用pH計測定其pH值和氧化還原電位。

1.3.2窖泥中金屬離子的測定[10]

為了測定窖泥中的金屬離子，該實驗采用NexION 350電感耦合等離子體質譜儀，具體操作如下：取少量窖泥，風干7 d后進行研磨，并過200目篩子。稱量0.2 g（精確至0.001 g），放置到消解罐中，在消解罐中加入4 mL硝酸（HNO3），2 mL H2O2，2 mL氫氟酸（HF）后置于微波消解儀中消解1 h。消解結束后，加入1 mL高氯酸（HClO4），放置到加熱板上，蒸發至剩余1 mL左右。消解罐中的樣本轉入50 mL的定容瓶中，用1%的HNO3進行定容，再用1%的HNO3將其稀釋100倍進行上機測試[13-14]。

1.3.3窖泥中有機酸的測定

采用ISC3000離子色譜儀對窖泥中有機酸進行測定。取窖泥5g，溶解于25mL的超純水中，充分振蕩后，1 800 r/min離心10 min；采用0.45 μm的水相膜進行過濾，稀釋100倍后上機測樣。儀器設置條件如下：柱子型號為IONPAAG11-HC（4 mm×50 mm），柱溫30℃，氮壓6 kPa。為了保證樣品數據的真實性，需每隔5個樣本加入一個標準樣（質量濃度為50 μg/L的乳酸）進行校正。

1.3.4窖泥鈣化的緩解措施

表1　實驗中窖泥3種添加方式的添加量Table 1　Additive amounts of pit muds by three measures in the experiments

由于雙溝酒廠窖泥鈣化現象較為嚴重，在對其窖泥進行了理化性質探究的基礎上，主要采取了以下3種措施：①加入產堿菌（Alcaligenessp.）液；②加入酒花酸浸提液；③加入Nisin；制備方式，添加量及所用窖泥、酒醅量詳情見表1。將3種制備液與窖泥混合均勻，然后涂抹到小型瓷罐壁上，加入酒醅后密封。經過40 d的發酵，并結合窖泥和酒醅理化指標，以此來判斷這些措施是否有效。

1.3.5酒醅中風味物質的測定

取發酵完成后的酒醅25 g，加入50 mL體積分數為70%的乙醇，蒸餾出25 mL，然后過0.45 μm的有機膜，進行氣相色譜檢測。氣相色譜條件：CP-Wax 57 CB毛細管柱（50 m×0.25 mm×0.2 μm），載氣（高純氮）：流速1 mL/min，分流比：10∶1；氫氣：流速為45 mL/min；空氣：流速為450 mL/min；檢測器溫度270℃；進樣器溫度240℃；進樣量1 μL。為了保證測得結果的準確性，加入3個混合內標，其分別為異戊醛、異戊醇、己酸異戊酯。

2　結果與分析

2.1窖泥鈣化的成因

為了找到窖泥鈣化的形成原因，將鈣化窖泥和優質窖泥的理化性質（水分含量、pH值、氧化還原電位、金屬離子和有機酸含量）進行對比。

2.1.1窖泥含水量、pH值和氧化還原電位

根據前人研究發現，鈣化窖泥相對于優質窖泥，其主要表現為窖泥僵硬，甚至出現白色晶體，且其主要發生在窖泥使用周期的中后期。因此窖泥質量的優劣，最直觀的表現即為含水量和pH值。鈣化窖泥和優質窖泥在含水量、pH值和氧化還原電位方面的對比結果見表2。

表2　窖泥的含水量、pH值和氧化還原電位Table 2　Moisture content,pH and redox potential of the pit mud

由表2可知，鈣化窖泥無論是窖底還是窖壁，其含水量均較低；pH值也較低，而氧化還原電位較高。同時發現窖池的窖壁含水量高于窖底；而窖底的pH略高，氧化還原電位較低，提高窖泥的pH值可能是緩解窖泥發生鈣化的一個途徑。因此結合生態釀酒的理念，提出采用添加產堿桿菌，從微生物的角度改善窖泥的鈣化現象。

2.1.2窖泥中金屬離子

由于鈣化窖泥的主要成分是乳酸鈣及乳酸鐵結晶[15]，因此鈣、鐵等金屬離子是導致鈣化的主要原因，也是需要重點考察的因素之一。本實驗采集洋河和雙溝兩個基地的鈣化窖泥及未鈣化的窖泥進行對比分析，結果如圖1所示。

圖1　不同窖泥中主要金屬離子含量的對比Fig.1　Comparison of main metal ions contents in different pit mud

由圖1可知，鈣化窖泥比無鈣化窖泥中的Ca、Mg、Fe等金屬離子含量高，且雙溝基地的窖泥含量均高于洋河基地。計算得到洋河基地中的鈣化窖泥中的鈣離子約為無鈣化窖泥的17倍、鎂離子約12倍、鐵離子約5倍；而雙溝基地的鈣化窖泥中的鈣離子約為無鈣化窖泥的26倍、鎂離子約23倍、鐵離子約101倍。結果表明，洋河基地中的鈣化窖泥主要是鈣離子，而雙溝基地的鈣化窖泥中，鐵離子的含量遠遠高于其他窖泥，且高于鈣離子的含量。

2.1.3鈣化和無鈣化窖泥中有機酸的對比分析

由于窖泥普遍為酸性，且形成的鈣化結晶主要為有機酸鹽類[8]，因此需要對窖泥中的有機酸進行分析檢測，結果如圖2所示。

圖2　不同窖泥中的有機酸離子含量的對比Fig.2　Comparison of organic acid ions contents in different pit mud

由圖2可知，在各樣品中的乳酸含量較高，而鈣化樣品的乳酸含量更占有絕對優勢，同時存在一定量的乙酸。洋河基地的鈣化窖泥中的乳酸約為無鈣化窖泥的8倍；雙溝基地的為12倍。鈣化窖泥中乳酸大量增加，其含量遠遠超過了正常釀造體系中的乳酸含量，從而導致了鈣化現象的發生。因此若想緩解或解決鈣化的問題，需要一定程度上抑制有機酸產生菌，通過大量前期研究工作，本實驗選取1%的酒花酸浸提液和5‰的Nisin進行抑制有機酸產生菌的生長。

2.2三種措施緩解窖泥鈣化的結果

由于雙溝窖泥鈣化較為嚴重，因此特地選取雙溝窖泥進行實驗。通過對比實驗組和對照組窖泥在水分含量、pH值、氧化還原電位、金屬離子、有機酸和酒醅的風味物質方面的差異，以此來判斷措施的可行性。

2.2.1三種緩解措施在水分含量、pH值和氧化還原電位的對比

對發酵40 d后的窖泥進行了基本的指標測定，具體結果見表3。

表3　窖泥的基本理化指標Table 3　Basic physical and chemical indexes of pit mud

由表3可知，在發酵40 d后，經過三種措施處理后，發現其能顯著緩解窖泥的pH值降低，氧化還原電位升高的問題。而含水量則基本不變，推測可能由于實驗密封性較好，水分基本沒有揮發。而通過橫向對比，發現加入酒花酸浸提液和Nisin的窖泥在pH和氧化還原電位效果較好，尤其是酒花酸浸提液。

2.2.2金屬離子含量的結果對比

通過對比分析窖泥中金屬離子含量，特別是鈣離子和鐵離子，可以大體的了解窖泥的鈣化狀況。ICP-MS法測量得到的窖泥中金屬離子含量結果見表4。

表4　窖泥中部分金屬離子的含量Table 4　Contents of partial metal ions in pit mudmg/g

由表4可知，在發酵過程中，Na+、Mg2+、Al3+、Ca2+、Fe3+和Zn2+，都有顯著的提高，特別是Ca2+和Zn2+，分別提高了大約10倍和40倍；而通過前面鈣化窖泥和非鈣化窖泥的對比分析，了解影響窖泥鈣化的主要金屬離子是Ca2+、Fe2+和Mg2+，因此主要對這三種離子進行了分析，結果見圖3。

圖3　窖泥中3種金屬離子含量對比圖Fig.3　Comparison of 3 metal ions contents in pit mud

由圖3可知，窖泥中加入產堿菌、酒花酸和Nisin，都能夠有效降低窖泥中Ca2+、Fe3+和Mg2+，特別是加入產堿菌后；與對照組相比，其Ca2+降低了26.1%，Fe3+降低了15.1%，Mg2+降低了12.8%。通過采取的三種措施，能夠解決窖泥鈣化過程中金屬離子含量增多的問題，從而緩解了窖泥的鈣化；其中，效果最明顯的是加入產堿菌，這可能是由于升高了窖池的pH，減少了Ca2+、Fe3+等金屬離子形成乳酸鈣、乳酸鐵等沉淀的量。

2.2.3有機酸含量的結果對比

前期工作發現鈣化窖泥中乳酸根離子含量極高，因此在采取三種緩解措施后，本實驗針對有機酸根離子，特別是乳酸根離子進行了檢測，結果見表5。

表5　窖泥中各種有機酸的含量對比Table 5　Comparison of various organic acids contents in pit mud mg/g

由表5可知，在初始窖泥中，各種有機酸都是比較均勻，但是在經過發酵后，可以看出己酸、乙酸和丙酮酸都有所下降，特別是己酸，而乳酸則含量大增。雖然發酵后的乳酸大量增加，但經過三種措施處理后，其乳酸含量有著明顯的降低。在窖泥中加入產堿菌、酒花酸浸提液和Nisin處理后，分別下降了63.2%、62.0%、96.1%。結果表明Nisin的效果最佳。推測產生這種現象的原因是窖泥中的乳酸鈣、乳酸鐵等沉淀量下降，進而使乳酸含量降低，緩解窖泥的鈣化。

2.2.4酒醅中的風味物質對比

雖然采用三種措施可以一定程度上緩解窖泥的鈣化，但由于外源添加非釀酒物質，需要針對這些措施是否會影響最終的酒質進行評估。經過40 d的發酵，酒醅經過蒸餾，氣相色譜分析，酒醅中風味物質檢測結果見表6。

表6　酒醅中各種風味物質的對比Table 6　Comparison of various flavor substances in fermented grains mg/100 mL

由表6可知，經過三種措施的實施后，酒醅中的風味物質有所改變，酒醅中的己酸乙酯均有了顯著提高，乙酸乙酯也有所提高，乳酸乙酯有所下降。由于己酸乙酯是濃香型白酒中的主體呈香呈味物質，己酸乙酯含量增加有助于提高濃香型白酒的特有香氣、口感，并且經過專家鑒定酒質更加醇厚、酯香更加突出。因此采取加入Nisin這種措施，對酒質提升也是非常好的幫助。

3　結論

通過分析鈣化窖泥和非鈣化窖泥的理化性質，總結窖泥鈣化產生的原因主要有以下幾點：含水量的降低、pH的降低、氧化還原電位的升高、金屬離子的升高（主要是Ca2+、Fe3+和Mg2+）、乳酸含量的升高。這幾個原因之間是相互聯系的，例如，由于鈣化窖泥中含有較多的Ca2+和乳酸跟離子，其在pH較低、水分含量降低的環境下，會結晶形成白色的乳酸鈣。因此，要解決窖泥的鈣化問題，必須綜合治理；不能單獨根據單一指標來判斷某一項措施對窖泥鈣化問題緩解的成效。

經過采取加入產堿菌、酒花酸浸提液和Nisin措施后，研究發現這幾種措施對于緩解窖泥鈣化均有所幫助，不同的措施側重點不同，例如，酒花酸浸提液對于緩解窖泥含水量降低、pH降低、氧化還原電位升高方面有著較好的效果；產堿菌對于降低金屬離子，特別是Ca2+方面有著顯著效果；Nisin對于緩解窖泥含水量降低、pH降低、氧化還原電位升高等方面均有顯著的效果。

總體來說，窖泥中添加Nisin的效果更佳，其不僅可以改善窖泥鈣化的問題，還可以提高濃香型白酒的品質。

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Preliminary research on the calcification causes and mitigation measures of Luzhou-flavourBaijiupit mud

CHEN Bin1,YAN Yinzhuo1*,WANG Deliang1,CHEN Xiang2
(1.China National Research Institute of Food&Fermentation Industries,Beijing 100015,China; 2.Jiangsu Yanghe Distillery Co.,Ltd.,Suqian 223800,China)

Pit mud plays an important role in the quality of Luzhou-flavourBaijiu.However,at present,most manufactories find that the calcification of pit mud appears frequently,which directly influence the quality ofBaijiu.The physicochemical indexes of calcified pit mud and quality aged pit mud were compared.It was concluded that the main reasons of the pit mud calcification were low moisture content,low pH and other related factors, which might result in the formation of white crystal(calcium lactate and lactic acid,iron,etc)in pit mud to make it compacted,white patches appeared,and quality degraded.In order to alleviate the calcification of pit mud,three measures were carried out by addingAlcaligenessp.,hop α-acid extract liquid and Nisin in pit mud.The results showed that the all three measures could alleviate the calcification of pit mud,and adding Nisin had the optimal effects by comprehensive analysis.

pit mud;calcification;reason;mitigation measures

TS261.4

0254-5071（2016）10-0036-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.10.009

2016-07-19

國家自然科學基金資助項目（31401680）

陳彬（1990-），男，碩士研究生，研究方向為食品發酵。

閆寅卓（1986-），女，高級工程師，博士，研究方向為食品發酵。