類芽孢桿菌產β-甘露聚糖酶的分離與純化

張建新，穆廣亞，陳琳，李玲玲，聶國興*

（河南師范大學水產學院，河南新鄉453007）

類芽孢桿菌產β-甘露聚糖酶的分離與純化

張建新，穆廣亞，陳琳，李玲玲，聶國興*

（河南師范大學水產學院，河南新鄉453007）

類芽孢桿菌（Paenibacillussp.）CH-3是一株高產β-甘露聚糖酶的菌株。本研究采用乙醇沉淀法、硫酸銨鹽析法、聚乙二醇（PEG）/硫酸銨[（NH4）2SO4]雙水相體系對CH-3菌株產生的β-甘露聚糖酶進行分離與純化，以選出純化率高且殘余酶活力高的方法。結果發現，乙醇沉淀法和硫酸銨鹽析法純化效果較差，聚乙二醇（PEG）/硫酸銨[（NH4）2SO4]雙水相體系的純化效果較好，PEG濃度為20%（m/m）時,上相測得的總酶活力最高，可以達到221 U/mL。在（NH4）2SO4濃度為18%（m/m）時，上相測得總酶活力最高，可以達到264 U/mL，同時酶萃取率達最大值為86.2%。因此，最優的雙水相體系是20%（m/m）PEG和濃度為18%（m/m）（NH4）2SO4。

β-甘露聚糖酶；提取純化；雙水相體系

β-甘露聚糖酶（beta-mannanase）是一種可以專一性水解含β-1,4-甘露糖苷鍵的甘露多糖內切水解酶，屬于半纖維素酶類[1-2]。β-甘露聚糖酶在自然界中廣泛存在，由其水解產生的甘露寡糖在醫藥、功能性食品、保健領域表現出獨特的活性，已成為研究熱點[3]。

目前，國內外對甘露聚糖酶的研究主要集中在從環境中篩選產酶菌株[4-5]，對菌種進行誘導育種[6]，優化發酵產酶工藝[7-8]，將酶基因克隆在芽孢桿菌[9]、大腸桿菌[10-11]及畢赤酵母中異源表達[12]等方面。相關酶的分級提取方法國內外報道的主要有孟玲等[13-14]的雙水相體系萃取方法，向冰冰[15]的硫酸銨鹽析方法。本實驗通過乙醇沉淀法、硫酸銨鹽析法、聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）/硫酸銨[（NH4）2SO4]雙水相體系對類芽孢桿菌CH-3產生的β-甘露聚糖酶進行分離純化，得到最優的純化方法，為該酶的進一步開發利用奠定基礎。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1材料

菌株來源：本實驗室從刺槐中分離得到已經優化并保存的類芽孢桿菌（Paenibacillussp.）CH-3[3]。

磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、甘油、無水乙醇、酒石酸鈉、氫氧化鈉、氯化鉀、硫酸鎂、無水氯化鈣、苯酚、3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）、無水亞硫酸鈉、硫酸銨等（均為分析純）：天津市德恩化學試劑有限公司；聚乙二醇2000（分析純）：北京鼎國生物技術有限責任公司。

1.1.2培養基

活化培養基：魔芋粉20 g/L，酵母膏5 g/L，蛋白胨5 g/L，NaCl 5 g/L，121℃高壓滅菌30 min。

種子培養基：酵母膏5g/L，蛋白胨5g/L，MgSO40.3g/L，KCl 1 g/L，K2HPO41 g/L，121℃高壓滅菌30 min。

發酵培養基：魔芋粉20g/L，酵母膏10g/L，K2HPO42g/L，MgSO43 g/L，NaCl 1 g/L，（NH4）2HPO45 g/L，CaCl22 g/L，121℃高壓滅菌30 min。

LB培養基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 1 g/L，121℃高壓滅菌30 min。

1.2儀器與設備

ZHWY-2102C型恒溫培養振蕩器、ZHJH-C1112B型超凈工作臺：上海智城分析儀器制造有限公司；LDZX-75KBS型立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫療器械有限公司；Centrifuge5804R型低溫高速離心機：艾本德中國有限公司；XMTD-6000型恒溫水浴鍋：上虞市拓展儀器設備有限公司；Haier DW-86L 386超低溫冰箱：海爾電器集團有限公司；BL150型電子天平：上海丙林電子科技有限公司；UV-1800紫外可見光分光光度計：合肥橋斯儀器設備有限公司。

1.3實驗方法

1.3.1粗酶液的制備

將-70℃甘油管保存的菌種使用LB固體培養基劃線，37℃倒置恒溫培養16 h，挑取單菌落轉入活化培養基，在37℃、180 r/min條件下搖床培養24 h。按2%的接種量轉入種子培養基，在37℃、180 r/min搖床培養16 h。按2%的接種量轉入發酵培養基，在37℃、180 r/min搖床發酵72 h。將發酵液以5 000 r/min離心10 min，上清即為粗酶液。

1.3.2乙醇沉淀

無水乙醇在冰箱中預冷至-20℃，加入已經準備好的粗酶液中，分別調整乙醇用量為80mL/100 mL、100 mL/100 mL、150 mL/100 mL、200 mL/100 mL、300 mL/100 mL酶液，4℃靜置沉淀15 min，8 000 r/min離心10 min，收集沉淀，用預冷乙醇洗滌2次，用磷酸緩沖液溶解沉淀，DNS法測酶活。

1.3.3硫酸銨鹽析

參考向冰冰[15]所用硫酸銨鹽析法，在離心管中裝入一定體積粗酶液，邊攪拌邊加入不同量干燥的固體硫酸銨，使混合體系中硫酸銨的飽和度分別為20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%，4℃靜置過夜，10 000 r/min離心30 min，測混合體系中沉淀及上清液酶活力，繪制該粗酶液的鹽析曲線。

1.3.4雙水相萃取

參考孟玲等[13-14]采用雙水相萃取純化法，在22℃環境中，雙水相體系按照質量來配制。向離心管內依次加入酶液3 g，（NH4）2SO4質量分數16%，PEG2000質量分數20%，用水補充至體系總質量為10 g。以2 000 r/min離心8 min，溶液能夠分上、下相，讀取上相及下相體積，分別測上相和下相的蛋白含量和酶活力。雙水相萃取法處理后要經過透析，冷凍后干燥處理并保存。

1.3.5測定方法

酶活測定：參照AKIN T等[17]方法。粗酶液與底物反應生成的還原糖與DNS發生顯色反應，使用紫外可見光分光光度計測定波長540 nm處的吸光度值，代入標準曲線回歸方程，即可計算出酶活。酶活性單位定義：每分鐘水解甘露糖生成1 μmol還原糖所需要的酶量定義為甘露糖酶活力單位（U/mL）。計算公式：

X=m×N/（M×a×b）

式中：X為酶活，U/mL，m為還原糖生成量，μg；N為樣品的稀釋倍數；M為樣品的物質的量，g/mol；a為參與反應的酶量，mL；b為反應時間，min。

其他計算公式：

R=V上/V下

式中：R為相比；V上為上相體積，mL；V下為下相體積，mL。Ke=U上/U下

式中：Ke為β-甘露聚糖酶分配系數；U上為上相酶活，U/mL；U下為下相酶活，U/mL。

C（p）（C（e））=RKe/（1+RKe）

式中：Cp為總蛋白的萃取率，%；Ce為β-甘露聚糖酶的萃取率，%。

圖1　乙醇用量對上清與沉淀酶活的影響Fig.1　Effect of ethanol addition on enzyme activity of supernatant and precipitate

2　結果與分析

2.1乙醇沉淀

由圖1可知，當無水乙醇用量為80～150 mL/100 mL酶液時，隨著乙醇用量增加，上清測得的酶活逐漸下降，沉淀測得的酶活呈上升趨勢。當乙醇用量達到150 mL/100 mL酶液時，沉淀酶活出現下降趨勢。總體看來，在乙醇用量較小條件下上清測得的酶活較高，而沉淀酶活一直在較低水平波動。用乙醇純化法，酶活損失較多，因此這種方法不適合用于該酶的分離純化。

2.2硫酸銨鹽析

由圖2可知，隨著硫酸銨飽和度的不斷增加，上清液酶活逐漸下降，在硫酸銨飽和度為90%時上清液中的酶基本完全失活。硫酸銨飽和度在50%～60%之間，上清酶活下降的最為迅速，且飽和度為20%～50%的上清液酶活損失少、離心效果好，沉淀物無酶活即沉淀物為雜蛋白。在其飽和度為50%～90%的離心管中出現絮狀蛋白漂浮物，沉淀蛋白不易收集，上清液測得酶活較低。如圖2所示，在硫酸銨的飽和度在20%～50%時沉淀酶活處于較低水平，當硫酸銨飽和度＞50%時，沉淀中酶活迅速升高，在硫酸銨飽和度達到80%時，沉淀酶活達到最高73 U/mL。硫酸銨飽和度50%的體系中整體酶活較低，推測高濃度的硫酸銨可能使蛋白變性，使酶活降低。因此這種方法不適合用于該酶的分離純化。

圖2　硫酸銨飽和度對上清與沉淀酶活的影響Fig.2　Effect of(NH4)2SO4saturation on enzyme activity of supernatant and precipitate

2.3雙水相萃取

2.3.1PEG2000含量對酶分離的影響

雙水相體系中先固定（NH4）2SO4含量為16%，然后加入PEG2000在體系中達到的不同質量分數，離心分相后分別測其上相和下相的體積、酶活力及蛋白含量，結果如表1所示。

表1　PEG含量對酶分離的影響Table 1　Effect of PEG concentration on enzyme separation

由表1可知，PEG2000含量為14%～20%時，酶萃取率和蛋白萃取率均呈上升趨勢。PEG2000含量＞20%時酶萃取率開始下降，而蛋白萃取率逐漸上升。原因可能是當PEG2000含量較低時，（NH4）2SO4的鹽析作用在整個雙水相體系占主導作用，使離心管中酶主要分布在上相；隨著PEG含量不斷增加，體系中溶液的黏度增加，減少相間分子轉移的能力，相界面張力亦將增大。PEG2000含量為20%時，上相測得的總酶活力最高，可以達到221 U/mL，而且酶的萃取率也達到最高值81.4%。結果表明，PEG2000含量20%時萃取甘露聚糖酶效果最好。

2.3.2（NH4）2SO4含量對酶分離的影響

雙水相體系中先固定PEG含量為20%，然后加入硫酸銨在體系中達到不同濃度，離心分相后分別測其上相及下相的體積、酶活力及蛋白含量，結果如表2所示。

表2　硫酸銨含量對酶分離的影響Table 2　Effect of(NH4)2SO4concentration on enzyme separation

由表2可知，隨著（NH4）2SO4含量的逐漸增加，酶萃取率呈先上升后下降趨勢，但蛋白質萃取率呈先下降后上升趨勢。在（NH4）2SO4含量為18%時，上相測得總酶活力最高，可以達到264 U/mL，同時酶萃取率達最大值86.2%，蛋白質萃取率為53.2%，說明（NH4）2SO4含量為18%時萃取蛋白多為酶蛋白，萃取效果最好，推測其原因可能是由于鹽濃度過大，破壞了體系中酶表面的水化層，從而造成酶萃取率和分配系數下降；雙水相系統兩相之間的電位差遭到破壞，改變體系中成相物質的組成。結果表明，（NH4）2SO4含量18%時萃取甘露聚糖酶效果最好。

3　結論

研究發現大部分β-甘露聚糖酶以胞外誘導酶的形式存在于生物體中，目前對于胞外酶進行的分離純化操作大多采用方法是將獲得的粗酶液先經過有機溶劑沉淀或硫酸銨鹽析，然后通過凝膠層析、離子交換柱層析和親和層析等不同方法來進一步處理[18-20]。本實驗對β-甘露聚糖酶進行乙醇沉淀法、硫酸銨沉淀法、聚乙二醇（PEG）/硫酸銨[（NH4）2SO4]雙水相體系的分離純化研究。結果表明通過乙醇沉淀和硫酸銨鹽析不僅測得酶活較低，并且經過高速離心后上清中出現少許絮狀物質，經酶活測定此絮狀物質為酶蛋白，因此過程中酶活損失較多。導致這樣結果的原因可能是，在乙醇沉淀過程中，引起蛋白變性，從而降低酶活。而硫酸銨沉淀法的作用原理是蛋白質在高離子強度的溶液中，通過增加其自身的疏水作用，使得蛋白質趨于聚集，達到溶解極限，從而使蛋白沉淀析出的目的，在一定程度上也會使蛋白失活。聚乙二醇（PEG）/硫酸銨[（NH4）2SO4]雙水相體系對該酶的純化效果較好，體系中（NH4）2SO4含量18%、PEG2000含量20%效果最好，在此條件下，酶活力最高為264 U/mL，酶萃取率最大為86.2%。雙水相體系對于酶活影響相對較小，分析其原因可能是成相的聚乙二醇（PEG）是多羥基化合物，可以形成很多氫鍵，通過對蛋白質的有效脫水，降低蛋白質水解作用而起到穩定酶的作用。雙水相體系中PEG濃度較高，黏度較大，上下相不宜分離，測定酶活時造成一定的酶損失，但雙水相處理去除了部分雜蛋白及雜質，使酶保存較長時間，為進一步的精細分離奠定基礎。

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Separation and purification ofβ-mannanase fromPaenibacillussp.

ZHANG Jianxin,MU Guangya,CHEN Lin,LI Lingling,NIE Guoxing*
(College of Fisheries,Henan Normal University,Xinxiang 453007,China)

Paenibacillussp.CH-3 is a selective breeding bacterial strain ofβ-mannase with high yield.In order to choose the method with high purification rate and high residual enzyme activity，β-mannanase is purified by ammonium sulfate salting-out,ethanol precipitation and polyethylene glycol(PEG)/ammonium sulfate[(NH4)2SO4]aqueous two-phase systems.The result shows that ethanol precipitation method and ammonium sulfate salting-out method have poor purification effect,while polyethylene glycol/ammonium sulfate aqueous two-phase systems has better purification effect.When the PEG concentration is 20%(m/m),the total supernatant enzyme activity is the highest(221 U/mL).Meanwhile the extraction yield is up to 89.6%.When the[(NH4)2SO4]concentration is 18%(m/m),the total supernatant enzyme activity is the highest,the extraction yield is up to 86.2%.Therefore,the concentration of 20%(m/m)PEG and the concentration of 18%(m/m)(NH4)2SO4aqueous two-phase system could be the best.

β-mannanase;separation and purification;aqueous two-phase systems

TQ464

0254-5071（2016）10-0068-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.10.015

2016-06-12

河南省重點科技攻關（132102310293，142102210453）；河南省教育廳科學技術研究重點項目（14B180023）；河南師范大學國家級科研項目培育基金（2013PL10）

張建新(1974-)，男，副教授，博士，研究方向為微生物酶工程。

聶國興（1971-），男，教授，博士，研究方向為酶制劑開發與利用。