尾菜液體青貯菌劑制備及應用

邵建寧，彭章普，張文齊，麻和平，劉彩云，王潔，趙昊星

（甘肅省科學院生物研究所，甘肅蘭州730000）

尾菜液體青貯菌劑制備及應用

邵建寧，彭章普，張文齊，麻和平，劉彩云，王潔，趙昊星

（甘肅省科學院生物研究所，甘肅蘭州730000）

對植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)SD2、發酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum)SD4在5 L立瓶中分別進行培養，制備尾菜液體青貯菌劑。結果表明，在MRS液體培養基中37℃條件下，調控pH值，菌株SD2和SD4最適收獲期分別為24 h、20 h，菌株SD2與SD4配比為2∶1時青貯效果最佳，尾菜液體青貯菌劑總活菌數＞1×109CFU/mL。按0.5%接種量，進行廢棄白菜葉、青筍葉青貯發酵應用試驗，生產的尾菜青貯飼料品質良好，顏色淡黃色或黃綠色，酸香味濃郁，質地較松散，pH值＜4.0。研制的尾菜青貯菌劑適用于尾菜青貯。

尾菜；乳酸菌；青貯菌劑；制備；應用

隨著蔬菜產業的發展，蔬菜在收獲、凈菜加工、商品化處理與銷售環節，產生大量的尾菜。由于蔬菜產品具有較強的季節性，收獲和上市期短而集中，大量尾菜未被合理處理利用，而是當作垃圾隨意堆放或者簡單填埋，使尾菜不僅被浪費，而且造成了環境污染，給蔬菜產區的農業生產、農民生活、農村生態帶來了極大的負面影響[1-2]。尾菜中有機物和水分含量高，易腐爛變質不宜貯存。為解決尾菜污染環境，實現尾菜資源化利用，對經過分撿后無腐爛變質的尾菜進行青貯飼料制備，可以降低尾菜的營養物質損失，較長期保存尾菜的青鮮狀態，提高尾菜青貯飼料的適口性、消化率和營養價值[3-6]。添加乳酸菌青貯，從青貯開始時，乳酸菌就成為優勢菌群主導發酵進程，可以快速產生乳酸，迅速降低pH值，從而抑制腐敗菌活動，加速青貯料發酵，減少營養成分損失，使尾菜中養分可以較好地保存，并使尾菜青貯飼料的品質得到顯著改善。國外許多研究者對乳酸菌在青貯飼料制備中的作用和應用進行了大量深入的研究，而我國在青貯飼料乳酸菌添加劑方面的研究應用還十分薄弱[7-13]。目前專門針對用于尾菜青貯的乳酸菌研究很少，自然青貯又不能保證尾菜青貯的品質。

本研究利用5 L立瓶進行尾菜青貯飼料發酵工藝研究，對選用的植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）SD2、發酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）SD4的培養確定了最適收獲期和配比，并對制備的尾菜液體青貯菌進行了應用試驗，目的是提高尾菜青貯飼料品質，取得良好的青貯效果，為尾菜液體青貯菌劑的工業化生產提供實驗數據和科學依據。對防止尾菜造成環境污染，減少尾菜浪費，實現尾菜資源化利用和促進蔬菜產業可持續發展具有重要意義。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1菌種

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）SD2、發酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）SD4：甘肅省科學院生物研究所保藏。

1.1.2培養基

MRS培養基[14]：酪蛋白胨10 g/L，牛肉粉10 g/L，酵母浸粉5 g/L，葡萄糖5 g/L，乙酸鈉5 g/L，檸檬酸氫二銨2 g/L，吐溫80 1 mL/L，K2HPO42 g/L，MgSO4·7H2O 0.02 g/L，MnSO4·H2O 0.05 g/L，瓊脂粉15 g/L，蒸餾水1L，pH 6.8。MC培養基[15]：大豆蛋白胨5 g/L，牛肉粉5 g/L，酵母浸粉5 g/L，葡萄糖20 g/L，乳糖20 g/L，CaCO310 g/L，瓊脂粉15 g/L，中性紅0.05 g/L，蒸餾水1 L，pH值6.0。

1.1.3尾菜

無腐爛變質的廢棄白菜葉、青筍葉：蘭州定西南路菜市場。

1.1.4化學試劑

蛋白胨、酵母浸出粉、牛肉粉、大豆蛋白胨、瓊脂粉：北京奧博星生物技術有限責任公司；葡萄糖、乳糖：天津市百世化工有限公司；吐溫-80：上海大眾制藥廠；K2HPO4、MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O、CaCO3：北京化工廠。所用化學試劑均為分析純或生化試劑。

1.2儀器與設備

5 L立瓶：成都蜀玻集團；DELTA 320 pH計：梅特勒-托利多（METTLER TOLEDO）集團公司；UV-120-02型分光光度計：日本島津公司；JA2003N電子天平：上海精密儀器有限公司；DG-1多功能培養箱：上海醫療器械修造廠；BH-2顯微鏡：日本奧林巴斯（中國）有限公司。

1.3方法

1.3.1液體青貯菌劑制備

將試管活化好的菌種，按5%（V/V）接種量接入500 mL三角瓶進行種子液培，37℃培養12 h。將三角瓶種子液按體積比5%的接種量接入5 L立瓶，在37℃條件下進行發酵培養，當pH＜5.5時用6 mol/L NaOH溶液調節發酵菌液pH至6.0～6.5。植物乳桿菌SD2、發酵乳桿菌SD4在各自調控pH值培養的生長曲線達到最高值時，終止發酵。以未調控pH值的菌株培養為對照，通過鏡檢確定沒有雜菌，進行菌落計數，確定菌液活菌數＞1×109CFU/g，備用。

1.3.2生長曲線的測定

菌種活化擴培后，以5%（V/V）接種量（菌種活菌數約為1×108CFU/mL）接種于液體MRS培養基中，37℃條件下培養32 h，分別于0、4 h、8 h、12 h、16 h、20 h、24 h、28 h、32 h取樣，用分光光度計在波長600 nm條件下比色，測定菌液的吸光度值。以培養時間為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制生長曲線。

1.3.3活菌數測定

（1）發酵菌液活菌數測定

取1 mL待測定發酵菌液，用稀釋液進行10倍梯度稀釋，選取10-6、10-7稀釋梯度，吸取0.2 mL菌懸液置于MRS瓊脂平板上，每個稀釋梯度做3個平行，以滅菌的涂布器將菌懸液均勻涂開，然后將平板倒置于培養箱中，37℃條件下培養48 h，進行菌落計數[16-17]。

（2）尾菜飼料乳酸菌總數測定

取5 g尾菜青貯飼料和45 mL無菌水混勻，以10倍梯度稀釋，選取10-5、10-6稀釋梯度，吸取0.2 mL菌懸液用涂布棒涂布于MC瓊脂平板上，培養48 h后，選擇菌落為紅色、周圍有明顯溶鈣環的菌落進行計數（乳酸菌發酵糖產酸使菌落周圍碳酸鈣溶解，出現溶鈣環，中性紅為pH指示劑）。

1.3.4pH值測定

稱取尾菜青貯樣品20 g，加入180 mL蒸餾水，使用組織搗碎機搗碎，然后用4層紗布紗布和濾紙分別進行過濾，測定過濾液的pH值。

1.3.5營養成分檢測

粗蛋白測定采用國標GB/T6432—1994《飼料中粗蛋白測定方法》；粗脂肪測定采用國標GB/T 6433—2006《飼料中粗脂肪的測定方法》；粗纖維測定采用國標GB/T 6434—2006《飼料中粗纖維測定方法》。

1.3.6菌株配比確定

植物乳桿菌SD2、發酵乳桿菌SD4的發酵液按活菌數比例1∶1、2∶1、1∶2進行配比，按0.5%接種量接種到經過預處理的廢棄白菜葉、青筍葉中，裝袋壓實封口，每組3平行。置于恒溫培養箱中，30℃條件下青貯發酵，分別于0～10 d每天取樣，測定各袋樣品中的pH值。

1.3.7青貯發酵試驗

挑選無腐爛變質的廢棄白菜葉、青筍葉進行清洗，切割成長2 cm、寬3 cm，采用晾曬使廢棄白菜葉、青筍葉水分含量降至70%左右。將分別發酵好的植物乳桿菌SD2、發酵乳桿菌SD4按一定比列混合，制備的尾菜液體青貯菌劑總活菌數＞1.0×109CFU/mL，尾菜液體青貯菌劑按照接種量0.5%，分別均勻噴灑到5 000 g青筍葉、5 000 g白菜葉中，裝入單向排氣閥青貯袋，裝袋后壓實、袋口密封，在30℃條件下發酵7 d，測定尾菜青貯飼料pH值及活菌數，綜合尾菜青貯飼料感官指標，評價液體青貯菌劑的發酵性能。

2　結果與分析

2.1最適發酵時間的確定

乳酸桿菌在生長繁殖過程中分解代謝產生酸，隨著酸度的升高，pH值的下降，乳酸桿菌的生長受到抑制。為了促進乳酸桿菌的生長和繁殖，植物乳桿菌SD2、發酵乳桿菌SD4各自在5 L立瓶培養過程中，以培養時間為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制各自調節pH組和對照組的生長曲線，結果見圖1。

由圖1可知，植物乳桿菌SD2、發酵乳桿菌SD4調節pH組的乳酸菌數明顯高于對照組。植物乳桿菌SD2在24 h左右達到生長高峰期，之后趨于穩定。因此，選擇發酵時間24 h為植物乳桿菌SD2的最佳收獲期，此時發酵液活菌數可達1.8×109CFU/mL。發酵乳桿菌SD4在20 h左右達到生長高峰期，之后趨于穩定。因此，選擇發酵時間20 h為發酵乳桿菌SD2的最佳收獲期，此時發酵液活菌數可達1.7×109CFU/mL。

圖1　植物乳桿菌SD2及發酵乳桿菌SD4生長曲線Fig.1　Growth curves ofL.plantarumSD2 andL.fermentumsSD4

2.2單菌與混菌青貯發酵

將植物乳桿菌SD2、發酵乳桿菌SD4與SD2和SD4按活菌數1∶1混菌接種在預處理后的廢棄白菜葉、青筍葉中，測定尾菜青貯飼料pH值，結果見圖2。

圖2　不同菌株青貯過程中pH變化Fig.2　pH changes of different strains in the process of silage

由圖2可知，SD2和SD4混菌發酵較單菌株發酵pH降低快，在5 d內pH降低到4.0以下，單菌株SD2、SD4青貯發酵在7 d內發酵pH降低到pH4.0以下。單菌與混菌青貯發酵7 d后pH值、乳酸菌活菌數及尾菜青貯飼料感官指標，結果見表1。

表1　不同菌株青貯尾菜感官結果Table 1　Evaluation of vegetable wastes ensiled by different strains

由表1可知，菌株SD2、SD4發酵廢棄白菜葉、青筍葉7 d后，尾菜青貯飼料pH均低于4.0，乳酸菌數量大于1.0× 108CFU/g，顏色、氣味、質地等感官指標良好，適合用于尾菜青貯飼料的發酵。菌株SD2和SD4混菌青貯發酵pH降低較快，說明混菌發酵較單菌發酵更具優勢。

2.3菌株配比確定

植物物乳桿菌SD2、發酵乳桿菌SD4的混菌發酵液按活菌數1∶1、2∶1、1∶2比進行配比，按0.5%接種量接種到廢棄白菜葉、青筍葉中，30℃條件下青貯發酵，分別于0～10 d內每天取樣，測定各袋樣品中的pH值，結果見圖3。

由圖3可知，植物乳桿菌SD2、發酵乳桿菌SD4菌株間不同的配比，其pH值變化趨勢不同，產生了不同的發酵過程。在發酵初期，各處理的pH值相近，在發酵7 d后到pH變化均趨于穩定。植物乳桿菌SD2、發酵乳桿菌SD4配比為2∶1的青貯試驗pH值最低，其pH值下降速率也最快，在4 d時pH值下降至4.0以下，7 d后下降緩慢，基本趨于穩定。因此，當植物乳桿菌SD2、發酵乳桿菌SD4菌株活菌數的配比為2∶1時，充分發揮了其協同作用，能快速啟動發酵，產生大量的有機酸使環境中的pH值迅速降低，最后穩定在3.8左右，有利于尾菜青貯飼料的長期保存。

圖3　菌株不同配比青貯發酵過程中pH變化Fig.3　pH changes of different ratio of the strains in the process of silage fermentation

2.4青貯效果評定

植物乳桿菌SD2、發酵乳桿菌SD4菌株活菌數的配比為2∶1，按0.5%接種量分別噴灑到廢棄白菜葉、青筍葉中。通過目測、嗅聞、手感感官檢驗，pH值測定和活菌數計數，判斷青貯飼料發酵效果，結果見表2。廢棄白菜葉、青筍葉在青貯前后營養成分變化結果見表3。

表2　尾菜液體青貯菌劑發酵尾菜結果Table 2　Results of vegetable wastes fermented by liquid silage bacterial inoculants

由表2可知，制備的尾菜液體青貯劑接種廢棄白菜葉、廢棄青筍葉發酵7 d后發酵效果較好，pH值均＜4.0，達到了較長期保存尾菜的效果。其中青貯廢棄白菜葉顏色淡黃色，酸香味濃郁，質地較松散、柔軟、不發粘，7 d后pH值為3.85，乳酸菌總數達到3.6×108CFU/g。青貯廢棄青筍葉，顏色黃綠色，酸香味濃郁，質地松散、柔軟、不發粘，7 d后pH值為3.9，乳酸菌總數達到3.3×108CFU/g。使用制備的尾菜液體青貯劑對廢棄白菜葉、青筍葉進行青貯發酵試驗，進一步證明植物乳桿菌SD2、發酵乳桿菌SD4共同作用青貯發酵效果良好（見表3）。

表3　尾菜青貯前后營養成分變化Table 3　Changes of nutrition components of vegetable wastes before and after the silage

由表3可知，尾菜青貯后粗蛋白和粗脂肪含量均有提高，粗纖維含量略有降低，從青貯后營養成分變化分析，使用制備的尾菜液體青貯劑提高了原尾菜營養性和可消化率。

3　結論

植物乳桿菌SD2在MRS液體培養基中37℃培養，通過調控pH值，24 h左右活菌數達到最大值，發酵液活菌數可達1.8×109CFU/mL；發酵乳桿菌SD4在MRS液體培養基中37℃培養，通過調控pH值，20 h左右活菌數達到最大值，發酵液活菌數可達1.7×109CFU/mL。

植物乳桿菌SD2與發酵乳桿菌SD4活菌數配比2∶1，按質量比0.5%接種量接種，30℃青貯尾菜在4 d時pH值下降至4.0以下，7 d基本趨于穩定。制備的尾菜液體青貯菌劑發酵廢棄白菜葉、廢棄青筍葉，青貯效果良好，尾菜青貯飼料顏色淡黃色或黃綠色，酸香味濃郁，質地較松散、柔軟、不發粘，尾菜青貯飼料pH值均＜4.0，達到了較長期保存尾菜的要求。

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Preparation and application of bacterial inoculants for vegetable wastes silage

SHAO Jianning,PENG Zhangpu,ZHANG Wenqi,MA Heping,LIU Caiyun,WANG Jie,ZHAO Haoxing (Institute of Biology,Gansu Academy of Sciences,Lanzhou 730000,China)

By the cultivation ofLactobacillus plantarumSD2 andLactobacillus fermentumSD4 in 5 L roller bottle,the bacterial inoculants for vegetable wastes silage were prepared.The results showed that in MRS liquid medium,at fermentation temperature 30℃,by adjusting pH value,the optimum harvesting time ofL.plantarumSD2 andL.fermentumSD4 were 24 h and 20 h,respectively.Under the condition ofL.plantarumSD2 and L.fermentumSD4 ratio 2∶1,the silage effect was the optimum,and the total viable count of bacterial inoculants for vegetable wastes silage was more than 1×109CFU/ml.The waste Chinese cabbage leaves and asparagus leaves were fermented by silage bacteria inoculants with inoculum 0.5%,and the vegetable wastes silage had good quality,light yellow or yellowish green color,strong acid fragrance and friable texture.The both vegetable wastes silage pHs were less than 4.0.The silage bacteria inoculants developed were suitable for the vegetable wastes silage.

vegetable waste;Lactobacillus;silage bacterial inoculants;preparation;application

Q939.97

0254-5071（2016）10-0095-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.10.021

2016-08-11

蘭州市科技計劃項目(2012-2-143）

邵建寧（1971-），男，高級工程師，本科，主要從事生物工程應用基礎研究工作。