鏈霉菌CSDX076次級代謝產物Pseurotin A的分離及結構鑒定

錢聲艷，李宇真，邵美云，程桂廣，保玉心，岳昌武*

（1.遵義醫學院醫學與生物學研究中心，貴州省微生物資源及藥物開發特色重點實驗室，貴州遵義563000；2.昆明理工大學化學工程學院，云南昆明650093）

鏈霉菌CSDX076次級代謝產物Pseurotin A的分離及結構鑒定

錢聲艷1，李宇真2，邵美云1，程桂廣2，保玉心1，岳昌武1*

（1.遵義醫學院醫學與生物學研究中心，貴州省微生物資源及藥物開發特色重點實驗室，貴州遵義563000；2.昆明理工大學化學工程學院，云南昆明650093）

對從赤水丹霞山土壤樣品中分離得到的鏈霉菌(Streptomyces sp.)CSDX076進行液體發酵。利用乙酸乙酯萃取，硅膠柱層析、薄層層析和反相中壓柱層析對發酵液中的次級代謝產物進行分離、純化；通過核磁共振法對純化的分離產物進行結構鑒定。結果表明，該研究從鏈霉菌屬中成功分離得到次級代謝產物Pseurotin A。采用濾紙片法對Pseurotin A進行抗菌活性測試，Pseurotin A對金黃色葡萄球菌具有抑制作用，其抑菌圈直徑為5.0 mm。

鏈霉菌CSDX076；次級代謝產物；Pseurotin A；結構鑒定

目前臨床使用的抗生素一半以上來自放線菌，其來源的生物活性物質超過20 000個，其中抗生素類活性天然產物超過10 000個，在治療微生物感染和腫瘤等疾病方面發揮了至關重要的作用。但是由于抗生素的濫用等諸多原因，近年來臨床上發現的病原菌耐藥性問題越來越嚴重，為許多疾病的治療與預防帶來極大困難，嚴重威脅著人類健康[1-3]。因此，加大抗生素研發力度，尋找或發現新型抗生素迫在眉睫[4-5]。隨著普通生境分離放線菌中發現新抗生素越來越困難，人們開始把目光轉向特殊生境或典型生境，并在沙漠[6]、海洋[7]、植物內生菌[8]等特殊生境中發現了新活性天然產物或新來源。

作為自然界中種類和數量最多的藥物微生物，鏈霉菌具有種類繁多，生長速度快，次級代謝產物豐富且成藥潛力大、培養簡單等特點，并且通過改變其培養條件、基因工程操作等手段，可激活或促進更多結構多樣及復雜的新型活性次級代謝產物合成，具有化學合成發現新藥等方法所不可比擬的優越性[9-11]。因此，從典型生境中分離鏈霉菌，利用其生理學特性結合相應的理化及遺傳學操作等，可望從中獲得新抗生素物質或為已有潛力化合物提供的新菌株來源。

本實驗室曾對黔北地區典型生境來源2 000余株放線菌分離菌株進行了篩選和次級代謝產物開發，并在1株梵凈山土壤來源的稀有鏈霉菌分離菌株Streptomycessp. FJS31-2的發酵產物中得到新型鹵化II型聚酮類化合物Zunyimycin A及其系列衍生物[12]。在此基礎上，課題組利用高分辨質譜分析技術對赤水丹霞土壤中分離純化的59株鏈霉菌的發酵產物進行分析，發現鏈霉菌Streptomycessp. CSDX076[13]可產生多種次級代謝產物。在優化發酵條件的基礎上，本研究對該菌的次級代謝產物進行分離與鑒定，采用核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）技術對其結構進行了鑒定，以期為該類化合物發酵及應用提供新的生物來源。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

發酵菌株：鏈霉菌Streptomycessp.CSDX076（菌保號：CCTCC M2014241）：分離自貴州赤水丹霞山海拔600 m的次生林地10～20cm深的表層土壤，該菌表現出具有抗藤黃微球菌（CGMCC 1.2156）活性[13]。

發酵培養基：葡萄糖4 g，CaCO32 g，麥芽抽提物10 g，酵母抽提物4 g，瓊脂粉15 g，加去離子水定容至1 L。

測試菌株培養基：哥倫比亞血瓊脂培養基、葡萄糖美蘭培養基（真菌培養基）及Mueller-Hinton瓊脂培養基：鄭州貝瑞特公司。

鮑曼不動桿菌（Acinetobacter baumannii）、糞腸球菌（Enterococcus faecalis）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、白色念珠菌（Candida albicans）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）：遵義醫學院附屬醫院保藏。

反相硅膠RP-18：德國Merck公司；薄層層析硅膠G254板及柱層析硅膠（200～300目）：青島譜科分離材料有限公司；甲醇、乙醇、氯仿、乙酸乙酯、丙酮等（均為分析純）：成都科龍化工試劑廠；甲醇、乙腈等色譜試劑（均為色譜級）：北京邁瑞達公司。

1.2儀器與設備

AVANCE III Bruker-500 MHz NMR核磁共振波譜儀：德國Bruker公司；Sepacore中壓制備液相色譜系統：瑞士步琦有限公司；HD-21-2紫外檢測儀：上海予騰生物科技有限公司；R-210旋轉蒸發儀：瑞士步琦有限公司；BSP-400培養箱：上海博訊醫療生物儀器股份有限公司；E002092超級潔凈工作臺：蘇州市金凈凈化設備科技有限公司；JA2003電子天平：上海越平科學儀器有限公司；ZF-1紫外分析儀：杭州齊威儀器有限公司；DZ-900培英搖床：太倉市實驗設備廠；Master-E超純水機：上海和泰儀器有限公司；二氧化碳培養箱：美國Thermo公司。

1.3方法

1.3.1菌株Streptomycessp.CSDX076活化與發酵

取斜面保存的菌株Streptomycessp.CSDX076的孢子，劃線接種于含有150 mL的發酵培養基，28℃靜置培養3 d以活化目的菌株。將活化菌株Streptomycessp.CSDX076接種至發酵培養基，28℃靜置培養5 d，以獲得目的菌株的種子菌。取2環孢子茂密的種子菌的孢子，均勻涂布于發酵培養基表面，28℃靜置培養5 d，搗碎固體培養基，攪拌均勻，繼續培養3 d。

1.3.2菌株發酵產物萃取

取固體發酵產物（含固體培養基），加入與培養基等體積（即150 mL）的乙酸乙酯，置于落地式搖床，于室溫條件下，110 r/min萃取12 h，共萃取3次。收集萃取液，置于旋轉蒸發儀中，減壓濃縮，回收萃取液，得到粗提浸膏（17 g）。

1.3.3目標代謝產物分離純化

將獲得的粗提浸膏用氯仿-丙酮混合溶劑溶解后，與硅膠按照質量比為1.0∶1.5的比例（即粗提浸膏17 g，加入硅膠25.5 g）混合均勻，待溶劑揮發后得到河沙狀的固體，作為硅膠柱層析的樣品。取100～200目硅膠300 g，以氯仿作為溶劑，裝柱。氯仿∶丙酮=4∶1（V/V）洗脫溶液洗脫，每250 mL為一份進行收集，共收集15份，每份經旋轉蒸發儀減壓回收氯仿-丙酮洗脫液后，浸膏樣品用少量丙酮溶出轉移到20 mL西林瓶，薄層層析（thinlayerchromatography，TLC）點板，石油醚∶丙酮=1∶1展開劑展開，用8%硫酸乙醇溶液顯色，并用紫外分析儀觀察，記錄并計算遷移值（Rf），合并遷移值（Rf）相同點的組分，共得到4份粗提品，并對4份粗提品進行抗菌活性測試，合并抗菌活性部分得到無色的粉末（2.782 g）。

具有抗菌活性的無色粉末部分用反相中壓柱層析純化，中壓條件：流速20 mL/min，最大柱壓40 bar，甲醇∶水= 1.0∶1.5（V/V）洗脫，每份收集250 mL洗脫液，共收集20份，每份用旋轉蒸發儀在53℃減壓濃縮回收洗脫溶劑后，用少量丙酮溶劑溶解轉移到20 mL西林瓶中，TLC點板，石油醚∶丙酮=1∶1展開，在波長為254 nm紫外燈下觀察有熒光，隨后用8%H2SO4溶液加熱顯色，并用紫外分析儀觀察，記錄并計算遷移值（Rf），合并相同遷移值（Rf）的組分，共得到5份粗樣品。對5份粗樣品進行抗菌活性測試，合并抗菌活性部分得到無色的粉末（126 mg）。

無色的粉末用石油醚-丙酮混合溶劑溶解后，與硅膠按照質量比為1.0∶1.5的比例（即126 mg，加入硅膠189 mg）混合均勻，待溶劑揮發后得到河沙狀的固體，作為硅膠柱層析的加樣樣品。取100～200目硅膠10 g，以石油醚∶丙酮= 3∶1（V/V）洗脫溶液洗脫，每25 mL為一份進行收集，共收集30瓶，薄層層析點板，石油醚∶丙酮=1∶1展開劑展開，用8%硫酸溶液顯色，合并遷移值Rf=0.5的化合物，最終得到化合物A。

1.3.4代謝產物結構鑒定

核磁共振譜：稱取化合物A 8mg，氘代甲醇溶劑溶解轉移到核磁管（溶劑不宜加多，最好不要超過核磁管1.5 cm），放到核磁共振儀中進行測試（在此過程中先開電源，使核磁管懸浮在均勻磁場中）。測試包括：1H NMR譜、13C NMR譜和DEPT譜。

采用電噴霧質譜（electrosprayionizationmassspectrom-etry，ESI-MS）測定：樣品加熱氣化，進入離子化室，隨后電離，得到化合物的分子離子峰及其他離子碎片。

1.3.5抗菌活性的測定

用接種環分別挑取鮑曼不動桿菌、糞腸球菌、金黃色葡萄球菌及銅綠假單胞菌的單菌落，劃線接種至哥倫比亞血瓊脂培養基，36℃、5%CO2培養12 h。用接種環挑取白色念珠菌的單菌落，劃線接種至葡萄糖美蘭培養基，28℃、5%CO2培養12 h。

采用濾紙片法測定抗菌活性。將濾紙片打孔（孔直徑為4 mm），121℃、30 min高壓滅菌；稱取質量為0.2 mg的化合物A溶于100 μL甲醇中，將濾紙片浸泡其中，取出紙片溶劑揮發干后備用。

純化好的測試菌用一次性拭子（已滅菌）沾取單菌落，置于含5 mL生理鹽水的玻璃試管中，潤濕拭子頭部輕輕在管壁上涂抹均勻，直至菌懸液比濁度0.44～0.56 MCF；用棉簽蘸取菌懸液并靠壁旋轉，十字交叉再均勻劃線涂抹在Mueller-Hinton瓊脂培養基上，待平板稍干后將制作好的濾紙片貼于培養基表面，每個濾紙片中心距離＞24 mm，每個平板4個濾紙片，做好標記倒置于微生物培養箱36℃培養17 h觀察，測量抑菌圈直徑。

2　結果與分析

2.1Pseurotin A分離純化

以石油醚∶丙酮=1∶1和氯仿∶丙酮=3∶1為展開劑，通過上述分離純化的方法，得到化合物A，化合物A的薄層層析色譜圖如圖1所示。

圖1　化合物A的薄層層析色譜圖Fig.1　Thin-layer chromatography of compound A

由圖1可知，化合物A在紫外分析儀波長254 nm處具有熒光，用TLC方法，分別用石油醚∶丙酮=1∶1和氯仿∶丙酮= 3∶1展開劑展開，A遷移值（Rf）約為0.5，8%硫酸顯色劑加熱顯色后，化合物A呈淺黃色。254 nm熒光及TCL板硫酸顯示的結果表明，化合物A為單一的化合物。

2.2化合物A結構鑒定

化合物A的結構鑒定：白色粉末，高分辨電噴霧質譜（high resolution electrospray ionization mass spectrometry，HR-ESI-MS）：m/z454.1474[M+Na]+，分子式：C22H25NNaO8，計算不飽和度為11；1H NMR（MeOD，500 MHz）：化學位移8.35（2H，dd，J=8.5，1.2 Hz，H-19，H-23），7.64（1H，t，J= 7.4 Hz，H-21），7.49（2H，m，H-20/H-22）5個氫質子信號；結合13C NMR（MeOD，125 MHz）及DEPT譜圖，碳原子的化學位移129.5×2（d，C-20，C-22），131.7×2（d，C-19，C-23），134.9（s，C-18），135.2（d，C-21）可以推斷該化合物含有苯環且苯環無取代；化學位移188.7（s，C-6），197.1（s，C-17），199.2（s，C-4）確定該化合物含有3個羰基；氫質子化學位移5.61（1H，m，H-13），5.45（1H，m，H-12）結合碳原子化學位移128.8（d，C-12），137.3（d，C-13），114.4（s，C-3），169.2（s，C-2）可以初步推斷該化合物具有2個雙鍵；化學信號69.5（d，C-10），72.9（d，C-11），76.3（d，C-9），結合氫信號化學位移4.66（1H，ddd，J=18.9，6.7，0.9 Hz，H-11），4.53（1H，s，H-9），4.50（1H，d，J=7.4 Hz，H-10）可以得到該化合物有連接氧原子的碳原子存在；化學信號3.33（3H，s，-OMe），1.75（3H，s，H-16）推斷出該化合物具有沒有耦合的單甲基，化學信號0.97（3H，t，J=7.5 Hz，H-15）及2.08-2.17（2H，m，H-14）的化學位移及耦合常數推斷出該化合物含有乙基基團，且乙基官能團是與雙鍵相連接；以上的各原子就共有9個不飽和度，結合該化合物11個不飽和度可以推斷化合物還具有兩個五元環；綜合以上信息，采用SciFinder數據庫，該化合物數據及結構特征與Pseurotin A[14]一致，化合物鑒定為Pseurotin A，其結構如圖2所示。

圖2Pseurotin A的結構Fig.2　Structure of Pseurotin A

2.3化合物A的抗菌活性測定

采用濾紙片法對Pseurotin A進行抗菌活性測試，以鮑曼不動桿菌、糞腸球菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌及銅綠假單胞菌為測試菌株，甲醇為陰性對照。結果表明（見表1），Pseurotin A對金黃色葡萄球菌具有抑制作用，其抑菌圈直徑為5.0 mm，而對鮑曼不動桿菌、糞腸球菌、白色念珠菌及銅綠假單胞菌沒有抑制活性。

表1Pseurotin A的抗菌活性檢測結果Table 1　Detection results of antimicrobial activity of Pseurotin A

3　結論

隨著海洋、沙漠等特殊生境的鏈霉菌株活性次級代謝產物[15]出現，為抗生素的研發提供物質來源，貴州同時具有喀斯特及早期的丹霞地貌，蘊藏了豐富的微生物資源，具有較大的開發價值。盡管目前已有多篇關于活性化合物Pseurotin A的報道，但其產生菌都是主要為煙曲霉等真菌[16]，未見該類化合物來自鏈霉菌的報道。本研究通過對從赤水丹霞山土壤樣品中分離得到的鏈霉菌Streptomyces sp.CSDX076的次級代謝產物進行分離及結構鑒定，在鏈霉菌屬中發現化合物PseurotinA，采用濾紙片法對PseurotinA進行抗菌活性測試，結果表明，Pseurotin A對金黃色葡萄球菌具有抑制作用，其抑菌圈直徑為5.0 mm，而對鮑曼不動桿菌、糞腸球菌、白色念珠菌及銅綠假單胞菌則顯示無抗菌活性。該研究為典型生境鏈霉菌次級代謝產物的研究提供理論基礎。

[1]VAILLANCOURT F H,YEH E,VOSBURG D A,et al.Nature's inventory of halogenation catalysts:oxidative strategies predominate[J].Chem Rev,2006,106(8):3364-3378.

[2]EUSTHQUIO A S,GUST B,LUFT T,et al.Clorobiocin biosynthesis in Strepiomyces[J].J Biol Chem,2003,10:279-288．

[3]HARRIS C M,KANNAN R,KOPECKA H,et al.The role of the chlorine substituents in the antibiotic Vancomycin:preparation and characterization of mono-and didechlorovancomycin[J].J Am Chem Soc,1985, 107:6652-6658.

[4]BISTER B,BISCHOFF D,NICHOLSON G J,et al.Bromobalhimycin and chlorobromobalhimycins-illuminating the potential of halogenses in glyeopeptide antibiotic biosyntheses[J].J Biol Chem,2003,4:658-662.

[5]PEREIRA E R,BELIN L,SANCELME M,et al.Structure activity relationships in a series of substituted indolocarbazoles:topoisomerase I and protein kinase C inhibition and antitumoral and antimicrobialproperties [J].J Med Chem,1996,39(22):4471.

[6]JIANG Z K,GUO L,CHEN C,et al.Xiakemycin A,a novel pyranonaphthoquinone antibiotic,produced by theStreptomycessp.CC8-201 from the soil of a karst cave[J].J Antibiot,2015,68:771-774.

[7]LACRET R,OVES-COSTALES D,GOMEZ C,et al.New ikarugamycin derivatives with antifungal and antibacterial properties fromStreptomyces zhaozhouensis[J].Mar Drug,2014,13:128-140.

[8]YANG X Q,PENG T F,YANG Y B,et al.Antimicrobial and antioxidant activity of a new benzamide from endophyticSreptomcessp.YIM67086 [J].Nat Prod Res,2015,29:331-335.

[9]SHINDO K,YAMAGISHI Y,KAWAI H.Thiazohalostatin,a new cytoprotective substance produced byActinomaduraII.Physico-chemical properties and structure determination[J].J Antibiot,1993,46(11):1638-1642.

[10]IGARASHI M,KINOSHITA N,IKEDA T,et al.Resormycin,a novel herbicidal and antifungal antibiotic produced bya strain ofStreptomyces platensisI.taxonomy,production,isolation and biological properties [J].J Antibiot,1997,50(12):1020-1025.

[11]TSUKAMOTO M,NAKAJIMA S,ARAKAWA H,et al.A new antitumorantibiotic,BE-19412A,produced byaStreptomycete[J].J Antibiot, 1998,51(10):908-914.

[12]LV Y H,YUE C W,SHAO M Y,et al.Molecular genetic characterization of an anthrabenzoxocinones gene cluster inStreptomycessp. FJS31-2 for the biosynthesis of BE-24566B and Zunyimycin A[J]. Molecules,2016,21:1-9.

[13]邵美云，李園園，岳昌武，等.抗多種病原微生物菌株的分離與鑒定[J].貴州農業科學，2014，42（7）：88-92.

[14]CHEN J M,WEI L B,ZHANG Y.Chemical constituents in petroleum ether fraction ofNerviliae fordii[J].Jinan Da Xue Xue Bao,2013,34: 324-327.

[15]AZRA J,SAIRA S,KHADIJA S,et al.Preparation,spectroscopic studies and biological activity of mono-organotin(IV)derivatives of nonsteroidal anti-inflammatory drugs[J].Turk J Chem,2004,28:629-644.

[16]SHI Y S,ZHANG Y,CHEN X Z,et al.Metabolites Produced by theEndophyticfungusAspergillusfumigatus from the stem ofErythrophloeum fordiiOliv[J].Molecules,2015,20(6):10793-10799.

Isolation and structural identification of Pseurotin A fromStreptomycessp. CSDX076 secondary metabolite

QIAN Shengyan1,LI Yuzhen2,SHAO Meiyun1,CHENG Guiguang2,BAO Yuxin1,YUE Changwu1*
(1.Guizhou Key Laboratory of Characteristic Microbial Research&Drug Development,Medical and Biological Research Center, Zunyi Medical University,Zunyi 563000,China;2.School of Chemical Engineering,Kunming University of Science and Technology,Kunming 650093,China)

TheStreptomycessp.CSDX076 isolated from Chishui Danxia mountain soil samples was fermented by liquid culture medium.The secondary metabolite in the fermented liquid was separated and purified by ethyl acetate extraction,slica column chromatography,thin-layer chromatography and reverse phase medium pressure column chromatography.The structure of purified products was identified by nuclear magnetic resonance method.The results showed that the secondary metabolite Pseurotin A was separated and obtained fromStreptomycessp.successfully.The antimicrobial activity of Pseurotin A was determined by filtering paper method.The results showed that Pseurotin A had inhibiting effect on Staphylococcus aureus,and the diameter of antibacterial circle was 5.0 mm.

Streptomycessp.CSDX076;secondary metabolites;Pseurotin A;structure identification

Q935

0254-5071（2016）10-0112-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.10.025

2016-03-28

國家自然科學基金（31160004，31460006），貴州省科技學技術基金項目（黔科合J字[2010]2156；黔科合J字[2012]2348；黔科合SY字[2013]3013）；遵義醫學院碩士啟動基金（F-757）

錢聲艷（1984-），女，助教，碩士，研究方向為天然藥物化學。

岳昌武（1975-），男，教授，博士，研究方向為微生物天然產物發現與生物合成。