甘蔗糖廠成糖工序生產(chǎn)線樣品中部分細(xì)菌菌株的鑒定

游彪，毛瑞豐*，許鳴銳，江燎瑩，劉雅楠，黃結(jié)

（廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院，廣西南寧530000）

甘蔗糖廠成糖工序生產(chǎn)線樣品中部分細(xì)菌菌株的鑒定

游彪，毛瑞豐*，許鳴銳，江燎瑩，劉雅楠，黃結(jié)

（廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院，廣西南寧530000）

通過(guò)16S rRNA序列分析，結(jié)合微生物的形態(tài)學(xué)觀察、生理生化試驗(yàn)對(duì)甘蔗糖廠成糖工序生產(chǎn)線檢出的部分細(xì)菌進(jìn)行了分離鑒定。結(jié)果顯示，從甘蔗糖生產(chǎn)線樣品中獲得常見(jiàn)的4株菌，菌株S-1鑒定為克氏庫(kù)克菌(Kocuria kristinae)、菌株S-2為蠟樣芽胞桿菌(Bacillus cereus)、菌株S-3為解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)、菌株S-4為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。因此，糖廠應(yīng)該加強(qiáng)微生物污染源和污染途徑的監(jiān)控，以此保證甘蔗糖品質(zhì)。

甘蔗糖；鑒定；克氏庫(kù)克菌；蠟樣芽胞桿菌；解淀粉芽孢桿菌；枯草芽孢桿菌

甘蔗糖作為甜味劑已經(jīng)有很長(zhǎng)的歷史了，除此之外它還能夠改變食品的風(fēng)味、色澤和質(zhì)地[1]，是一種天然的食品添加劑。由于其具有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分[2]，加上粗放的生產(chǎn)工藝，因此在壓榨時(shí)常常受到明串球菌屬（Leuconostoc sp.）[3-4]的污染，而在成品糖中極易受到嗜溫細(xì)菌、嗜熱細(xì)菌和嗜熱產(chǎn)芽孢菌[1]以及霉菌[5]的污染。

成品糖中的微生物極有可能來(lái)自上游工序—成糖工序，作為唯一的潔凈區(qū)，它依次包括落糖口、一級(jí)振篩、二級(jí)振篩、三級(jí)振篩、流化床、四級(jí)振篩，該工段也是糖廠進(jìn)行微生物控制的關(guān)鍵工序，但是它完全暴漏在空氣中且非常容易積垢。李揚(yáng)[5]在成糖工序曾對(duì)其中的霉菌做過(guò)相關(guān)的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)成糖工序檢出的菌株與成品糖中的菌株具有相關(guān)性。目前對(duì)甘蔗糖成糖工序的細(xì)菌種屬研究較少，在食品行業(yè)中還沒(méi)有意識(shí)到甘蔗糖中的細(xì)菌會(huì)對(duì)食品生產(chǎn)、貯藏以及消費(fèi)者的健康帶來(lái)多大的影響。因此，本研究立足于成品糖成糖工序的四級(jí)振篩這一關(guān)鍵控制點(diǎn)，研究該點(diǎn)的細(xì)菌種類(lèi)，為以后的研究做好鋪墊。

由于16S rRNA序列分析檢測(cè)技術(shù)具有時(shí)間短、靈敏度高、特異性強(qiáng)以及不依賴(lài)微生物的純培養(yǎng)技術(shù)的特點(diǎn)[6]，被廣泛運(yùn)用于食品[7-8]、藥品[9]、臨床[10]中細(xì)菌種類(lèi)的鑒定。本研究借助16S rRNA序列分析方法，對(duì)成糖工序四級(jí)振篩上物料中的細(xì)菌進(jìn)行分類(lèi)鑒定，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，以期為甘蔗糖中的微生物控制提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1樣品

甘蔗糖樣品：廣西壯族自治區(qū)某糖廠。

1.1.2培養(yǎng)基

胰蛋白胨大豆肉湯（trypticase soy broth，TSB）培養(yǎng)基：胰酶水解的酪素17.0 g/L，胃酶水解的大豆3.0 g/L，氯化鈉5.0g/L，磷酸氫二鉀2.5g/L，一水葡萄糖2.5 g/L，瓊脂20 g/L，pH值7.3±0.2（25℃），121℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.1.3試劑

結(jié)晶紫、孔雀綠、碘單質(zhì)、體積分?jǐn)?shù)95%乙醇溶液、葡萄糖、亞硝酸鹽（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

細(xì)菌脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒、PremixTaqTM：寶生物工程（大連）有限公司；27F/1492R通用引物：北京六合華大基因科技股份有限公司；Biowest Regular Agarose G-10：基因科技（上海）股份有限公司；4S Red Plus核酸染色劑：生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

SH11/YF-9光學(xué)顯微鏡：桂林市邁特光學(xué)儀器有限公司；5430R高速小型離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf公司；Mini-Sub Cell GT Cell電泳槽、164-5050 Powerpac Basic電泳儀、CHEMIDOC XRS免染電泳成像系統(tǒng)：美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3方法

1.3.1菌株的分離純化

在無(wú)菌條件下稱(chēng)量1 g四級(jí)振篩上的物料，置于已滅菌的平板中，取15 mL倒入已經(jīng)滅菌冷卻至50℃的TSB培養(yǎng)基中，輕輕搖動(dòng)平板，混合均勻，平放于無(wú)菌操作臺(tái)上，冷卻后倒置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)2 d。待培養(yǎng)基中長(zhǎng)滿菌落后，從平板中挑取單菌落于TSB培養(yǎng)基中劃線，37℃培養(yǎng)2 d，重復(fù)進(jìn)行上述劃線操作，直到獲得純化的菌株為止。

1.3.2菌株生理生化試驗(yàn)

對(duì)所得純化菌株進(jìn)行生理生化鑒定，試驗(yàn)操作參見(jiàn)《常見(jiàn)細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[11]。

1.3.316S rRNA基因序列分析

利用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒對(duì)菌株進(jìn)行基因組DNA的提取，方法步驟詳見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)。利用通用引物27F/1492R對(duì)基因組進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系見(jiàn)表1。反應(yīng)條件為：98℃變性10 s，55℃退火30 s，27次循環(huán)，72℃延伸96 s，得到16S rRNA基因片段，經(jīng)過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳，條帶明亮的樣品送至華大基因（深圳）測(cè)序。測(cè)序結(jié)果通過(guò)美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）網(wǎng)站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）進(jìn)行比對(duì)，從而確定與數(shù)據(jù)庫(kù)中序列相似性。并且利用MEGA 6中的鄰接法（neighbour-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

表1　PCR反應(yīng)液的組成Table 1　Composition of PCR reaction liquid

2　結(jié)果與分析

2.1菌株形態(tài)特征

經(jīng)過(guò)分離純化后，從四級(jí)振篩物料中得到菌株根據(jù)菌落特征和細(xì)胞形態(tài)特征，初步將分離菌株劃分為兩類(lèi)：L-1、L-2，常見(jiàn)的4株菌株為S-1、S-2、S-3、S-4。

表2　分離菌株的細(xì)胞和菌落形態(tài)特征Table 2　Cell and colony morphological characteristics of isolated strains

經(jīng)過(guò)上述初步的形態(tài)學(xué)鑒定，本試驗(yàn)又對(duì)這兩類(lèi)菌株進(jìn)行了革蘭氏染色、芽孢染色、運(yùn)動(dòng)性測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，分離菌株均為革蘭氏陽(yáng)性菌株（G+），L-1類(lèi)中的菌株不具有運(yùn)動(dòng)性，而L-2類(lèi)的菌株都具有運(yùn)動(dòng)性，且具有芽孢。因此，通過(guò)上述的形態(tài)學(xué)鑒定后，對(duì)分離純化過(guò)程中常見(jiàn)的4株菌S-1、S-2、S-3、S-4進(jìn)行生理生化試驗(yàn)。

2.2生理生化結(jié)果

分離菌株S-1、S-2、S-3、S-4、S-5的生理生化試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3　分離菌株生理生化試驗(yàn)結(jié)果Table 3　Results of physiological biochemical tests of isolated strains

由表3可知，參照《常見(jiàn)細(xì)菌鑒定手冊(cè)》初步鑒定菌株S-1為微球菌屬（Micrococcus）；菌株S-2、S-3、S-4為芽孢桿菌屬（Baciilus）。

2.316S rRNA序列分析與系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建

通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)16S rRNA擴(kuò)增電泳產(chǎn)物，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖見(jiàn)圖1。

由圖1可知，分離菌株的16S rRNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的分子質(zhì)量在1 000～2 000 bp之間。將分離菌株的16S rRNA序列測(cè)序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中已報(bào)道的模式菌株序列進(jìn)行比對(duì)，每種菌株列舉了3株近緣菌株，結(jié)果見(jiàn)表4。

圖1　分離菌株的16S rRNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.1　PCR amplification product electrophoretogram of 16S rRNA of isolated strains

表4　4株細(xì)菌的16S rRNA序列比對(duì)結(jié)果Table 4　Comparison results of 16S rRNA sequence of four strains of bacteria

由表4可知，菌株S-1與模式菌株克氏庫(kù)克菌（Kocuria kristinae）序列匹配率達(dá)到了98%；菌株S-2與模式菌株蠟樣芽胞桿菌（Bacillus cereus）序列匹配率達(dá)到了98%；菌株S-3與模式菌株解淀粉芽孢桿菌（Bacillusamyloliquefaciens）序列匹配率達(dá)到了99%；菌株S-4與模式菌株枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）序列匹配率也達(dá)到了99%。

采用MEGA 6軟件中的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖2～圖5。

圖2　菌株S-1基于16S rRNA序列建立的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2　Phylogenetic tree based on 16S rRNA sequence of strain S-1

圖3　菌株S-2基于16S rRNA序列建立的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3　Phylogenetic tree based on 16S rRNA sequence of strain S-2

圖4　菌株S-3基于16S rRNA序列建立的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.4　Phylogenetic tree based on 16S rRNA sequence of strain S-3

圖5　菌株S-4基于16S rRNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.5　Phylogenetic tree based on 16S rRNA sequence of strain S-4

由系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建結(jié)果可知，菌株S-1、S-2、S-3、S-4分別鑒定為克氏庫(kù)克菌（Kocuria kristinae）、蠟樣芽胞桿菌（Bacillus cereus）、解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

3　結(jié)論

本研究對(duì)甘蔗糖廠成糖工序四級(jí)振篩物料中的部分細(xì)菌菌株進(jìn)行分離鑒定，通過(guò)形態(tài)學(xué)、生理生化試驗(yàn)、16S rRNA序列分析，分離菌株S-1、S-2、S-3、S-4分別鑒定為克氏庫(kù)克菌（Kocuria kristinae）、蠟樣芽胞桿菌（Bacillus cereus）、解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

通過(guò)對(duì)檢出菌株的文獻(xiàn)檢索，本研究發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)中的四級(jí)振篩存在著可以致病的菌株：克氏庫(kù)克菌（Kocuria kristinae）[15]和蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）[16]，表明甘蔗糖有可能引起食源性疾病；產(chǎn)芽孢細(xì)菌的耐受性強(qiáng)，這將會(huì)對(duì)下游的食品加工中微生物的控制造成較大地影響。因此，在甘蔗糖的過(guò)程生產(chǎn)中有必要加強(qiáng)對(duì)細(xì)菌菌株的檢測(cè)和控制。

[1]WOJTCZAK M,BIERNASIAK J,PAPIEWSKA A.Evaluation of microbiological purity of raw and refined white cane sugar[J].Food Control, 2012,25(1):136-139.

[2]陳剛.甘蔗糖品中酚酸的抗氧化及抑菌性研究[D].廣州：華南理工大學(xué)，2011.

[3]EGGLESTON G.Deterioration of cane juice-sources and indicators[J]. Food Chem,2002,78(1):95-103.

[4]馮紫艷，陳山，陳瑋，等.甘蔗糖廠混合汁中代表性有害菌株的篩選[J].食品科技，2009，34（8）：10-13.

[5]李揚(yáng).甘蔗糖成品霉菌污染的微生物學(xué)分析[D].南寧：廣西大學(xué)，2013.

[6]王艷萍.16S rRNA基因及16S～23S rRNA基因間區(qū)在微生物鑒定中的應(yīng)用[J].國(guó)際校驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2013，4（8）：994-996.

[7]HOSSEINI H,HIPPE B,DENNER E,et al.Isolation,identification and monitoring of contaminant bacteria in Iranian Kefir type drink by 16S rDNA sequencing[J].Food Control,2012,25(2):784-788.

[8]PARLAPANI F F,BOZIARIS I S.Monitoring of spoilage and determination of microbial communities based on 16S rRNA gene sequence analysis of whole sea bream stored at various temperatures[J].LWT-Food Sci Tech,2016,66:553-559.

[9]范一靈，房蕊，蔣波，等.微生物鑒定分型技術(shù)應(yīng)用于醫(yī)藥企業(yè)微生物污染調(diào)查[J].中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志，2010（11）：810-817.

[10]RUDI K,ZIMONJA M,TROSVIK P,et al.Use of multivariate statistics for 16S rRNA gene analysis of microbial communities[J].Int J Food Microbiol,2007,120(1-2):95-99.

[11]東秀珠，蔡妙英.常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)[M].北京：科學(xué)出版社，2001：45-201.

[12]GARRITY G M，BELL J A，LILBURN T G.伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)[M].北京：科學(xué)出版社，1984：419.

[13]楊勝遠(yuǎn)，韋錦，李云，等.一株產(chǎn)抗菌活性物質(zhì)解淀粉芽孢桿菌的篩選及鑒定[J].食品科學(xué)，2010，31（21）：208-212.

[14]PRIEST F G,GOODFELLOW M,SHUTE L A,et al.Bacillus amyloliquefacienssp.nov.norn.rev[J].Int J Syst Evol Microbiol,1987, 37(1):69-71.

[15]SOHN K M,BAEK J,KIM S H,et al.Catheter-related bacteremia caused byKocuria salsicia:The first case[J].J Infect Chem,2015,21 (4):305-307.

[16]ORGANJI S R,ABULREESH H H,ELBANNA K,et al.Occurrence and characterization of toxigenicBacillus cereusin food and infant feces [J].Asian Pac J Trop Biomed,2015,5(7):515-520.

Identification of some bacteria strains from samples in sugar process production line of sucrose factory

YOU Biao,MAO Ruifeng*,XU Mingrui,JIANG Liaoying,LIU Yanan,HUANG Jie
(College of Light Industry and Food Engineering,Guangxi University,Guangxi Nanning 530000)

Some bacteria strains from samples in sugar process production line of sucrose sugar factory were isolated and identified by 16S rRNA sequence analysis,morphology observation and physiological biochemical tests.The results showed four strains of common bacteria were obtained from samples of sucrose sugar production lines.Strain S-1,S-2,S-3 and S-4 were identified asKocuria kristinae,Bacillus cereus,Bacillus amyloliquefaciensandBacillus subtilis,respectively.Therefore,sugar factory should strengthen the strengthen monitoring of microbial pollution source and pollution approach.

sucrose sugar;identification;Kocuria kristinae;Bacillus cereus;Bacillus amyloliquefaciens;Bacillus subtilis

TS207

0254-5071（2016）10-0126-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.10.028

2016-03-10

游彪（1991-），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称肺⑸铩?/p>

毛瑞豐（1963-），男，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称肺⑸铩?/p>