中慢生型天山根瘤菌MsiR組成型蛋白突變株的篩選

趙亞琪，馬騰，蔡韜*

（1.天津科技大學生物工程學院，天津300222；2.中國科學院天津工業生物技術研究所，天津300308）

中慢生型天山根瘤菌MsiR組成型蛋白突變株的篩選

趙亞琪1，2，馬騰1，2，蔡韜2*

（1.天津科技大學生物工程學院，天津300222；2.中國科學院天津工業生物技術研究所，天津300308）

MsiR蛋白來源于中慢生型天山根瘤菌（Mesorhizobium tianshanense），是LysR轉錄調控蛋白家族中的一員，它可以響應宿主植物釋放的抗代謝物-刀豆氨酸，激活外運蛋白msiA編碼基因的轉錄表達。通過構建MsiR突變文庫，篩選得到了7個MsiR組成型突變蛋白，L166P、A147V、P83L、A278T組成型突變蛋白喪失了對刀豆氨酸的響應，在沒有刀豆氨酸時的熒光值為800左右；A147T、E59G組成型突變蛋白仍然可以響應刀豆氨酸的誘導信號，添加刀豆氨酸時熒光值是未添加時的1.7倍。通過蛋白同源建模分析了組成型突變的氨基酸殘基在MsiR蛋白上的空間分布及其對MsiR蛋白調控功能可能的影響。組成型突變蛋白的研究對進一步揭示LysR家族蛋白轉錄調控的機理有重要意義。

LysR家族轉錄調控蛋白；MsiR蛋白；組成型突變；mCherry報告基因

中慢生型天山根瘤菌（Mesorhizobium tianshanense CCBAU3306）是1995年定義命名的新菌種，分離于新疆土壤，可在刺果甘草（Glycyrrlazeuralensis）的根部形成共生根瘤并進行固氮[1]；刀豆氨酸最早在1929年由日本科學家發現，是精氨酸的結構類似物，因此會被生物體誤摻入正在合成的多肽鏈中，形成沒有活性的蛋白質，最終導致生物體死亡。某些豆科植物會利用刀豆氨酸抵御昆蟲和食草性動物。L-刀豆氨酸（L-canavanine）因其毒性、抗代謝性被認為是一種潛在的殺蟲劑，另外，L-刀豆氨酸的抗腫瘤性是研究的熱點[2]。甘草種子萌發時會向周圍根際環境中釋放刀豆氨酸，刀豆氨酸作為抗代謝物可以清除土壤中的潛在致病微生物，然而天山根瘤菌卻可以在其根部大量繁殖并結瘤固氮，這主要是依賴于其體內的msiA/msiR調控系統。

msiA基因編碼一種氨基酸外運蛋白，負責轉運胞內刀豆氨酸；msiR基因編碼的MsiR蛋白是msiA基因表達所必需的，MsiR蛋白可以特異的識別胞內的刀豆氨酸，并結合到msiA的啟動子區，激活msiA基因的轉錄，MsiA蛋白將刀豆氨酸運出胞外[3-4]，降低胞內刀豆氨酸的濃度，去除刀豆氨酸對根瘤菌的毒性，使天山根瘤菌可以在甘草根際繁殖并形成根瘤固氮。

MsiR蛋白是一種轉錄調控蛋白，屬于LysR型轉錄調控蛋白家族中的一員，LysR家族轉錄調控蛋白是目前已知的最大的一類原核生物轉錄調控蛋白[5]。該家族蛋白可以識別小分子配體并調控多種基因的轉錄[6]，涉及細胞生長代謝、發育分裂[7]、固氮結瘤[8]、毒素產生[9-10]、氧壓感應、信號交流、群體感應[11]等多個過程。LysR家族蛋白通過突變文庫篩選以及定點突變的方法篩選得到了多種組成型表達的突變蛋白，如NodD1突變蛋白（K205N、D284N）[12]，CbbR突變蛋白（G96S、R136S、R155H）[13]，CysB突變蛋白（A227D、Y164N、Y197S）[14]等；這些位點的突變導致轉錄調控蛋白在沒有誘導物的情況下也可以激活目標基因的表達，推測這些位點可能影響調控蛋白對誘導物的結合、響應或者影響蛋白本身的聚集狀態和構象。LOCHOWSKA A等[14]在CysB組成型蛋白的研究中指出CysBcA227D突變可能改變了蛋白的聚集狀態，CysBcY164A突變可能改變了CysB蛋白的構象，使突變蛋白在不含誘導物的情況下始終保持激活誘導的狀態；KULLIK I等[15]在對OxyR研究中也發現OxyR（A233V）組成型突變使蛋白由野生型的四聚體狀態變成二聚體。組成型蛋白突變株的研究對我們進一步揭示LysR家族蛋白轉錄調控機理的奧秘有重要意義。

本研究以MsiR蛋白為研究對象，通過XL1-Red致突變菌株構建了MsiR蛋白的基因突變文庫，在含mCherry報告基因[16]及卡那霉素抗性雙篩選系統的篩選菌株中進行篩選并得到了7個組成型表達的蛋白；文章旨在建立了一種能夠簡單直觀并且可以實現高通量篩選突變蛋白的方法，為LysR家族轉錄調控蛋白的機理研究提供新的思路。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1菌種與質粒

致突變菌株大腸桿菌（E.coli）XL1-Red感受態細胞以及E.coliXL1-Blue感受態細胞：美國安捷倫科技有限公司；E.coliBW20767用作結合轉移供體菌、中慢生型天山根瘤菌（Mesorhizobium tianshanense）的msiR基因敲除菌株TC4：本實驗室保存；質粒pTCV151，含有Ptac-msiR基因片段，用于在天山根瘤菌中表達msiR基因；質粒pTM5（含有PmsiA-mCherry基因片段），mCherry基因的表達受msiA啟動子的控制，用于檢測msiR及其突變株的轉錄活性。

1.1.2試劑

鏈霉素（質量濃度為100 mg/L）、壯觀霉素（質量濃度為100 mg/L）、慶大霉素（質量濃度為20 mg/L）、卡那霉素（質量濃度為50 mg/L）：北京索萊寶科技有限公司；刀豆氨酸：西格瑪中國有限公司；PCR純化試劑盒膠回收試劑盒、高純度質粒小提試劑盒：美國Axygen公司。

1.1.3培養基

大腸桿菌采用LB培養基，37℃培養；LB培養基的成分：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，固體培養基瓊脂添加量為1.5%。

天山根瘤菌采用TY培養基，28℃培養；TY培養基的成分：胰蛋白胨5 g/L，酵母提取物3 g/L，CaCl20.67 g/L，固體培養基瓊脂添加量為1.5%。

1.2儀器與設備

SW-CJ-IFD超凈工作臺：蘇州蘇凈集團有限公司；Master cycle pro梯度PCR儀：德國Eppendorf公司；SpectraMax M5連續波長多功能酶標儀：美國MD公司；THZ-052小型恒溫搖床：上海博彩生物科技有限公司；SHP-150生化培養箱：上海森信試驗儀器有限公司；Microtron21961高通量振蕩培養系統：伊孚森生物技術（中國）有限公司。

1.3方法

1.3.1篩選菌株TC27（pTM5）的構建

本研究中構建了一個含雙篩選系統的篩選菌株：以TC4（中慢生型天山根瘤菌的msiR基因敲除菌株）為出發菌株，利用同源雙交換[17]法將沒有啟動子的卡那霉素抗性基因插入到msiA結構基因上，同時構建質粒pTM5，pTM5是將mCherry基因克隆到MsiR蛋白所調控的啟動子PmsiA下游，用于定量的檢測不同MsiR突變蛋白對PmsiA轉錄調控的影響，msiA啟動子的表達情況用mCherry熒光值與OD600nm的比值來表示；將pTM5電轉化至上述菌株中，構建成篩選菌株TC27（pTM5）。

1.3.2MsiR蛋白基因突變文庫的構建

采用XL1-Red致突變菌株構建MsiR突變文庫，致突變菌株的突變機制大都類似，這類菌株的DNA修復過程中的三個酶基因（錯配修復基因[18]、DNA聚合酶III 3′→5′核酸外切酶基因[19]和8-oxo-dGTP水解酶基因[20]）缺失，導致DNA復制過程的忠實性和準確性降低，致使基因發生突變。

（1）將XL1-Red化轉感受態在冰上解凍，取100 μL感受態于1.5 mL的EP管中，在冰上冰浴10 min，每2 min輕輕攪動一次。

（2）向感受態中加入50 ng左右的質粒pTCV151，輕輕混勻，冰浴30 min后42℃熱擊42 s，冰浴2 min，加入1 mL的LB液體培養基（于42℃預熱），37℃、220 r/min孵育1 h，取200 μL涂布于含慶大霉素的固體LB培養基中，37℃培養24 h。

（3）待菌落長出后，挑取200個左右的單克隆接種至20mL含有慶大霉素的液體LB培養基中，37℃、220r/min培養24 h。

（4）取5μL菌液轉接至10mL的含有慶大霉素的液體LB培養基中，37℃、220 r/min培養24 h，重復轉接3次。

（5）抽提質粒，電轉化至電轉感受態XL1-Blue中，37℃、220 r/min孵育1 h，涂布至含慶大霉素的固體LB培養基中，37℃培養過夜。

（6）收集菌體，加入50%甘油，-80℃保存，此為構建好的突變文庫。

1.3.3MsiR蛋白突變文庫篩選

取適量的含MsiR突變文庫（用MsiR*來表示MsiR突變蛋白）的篩選菌株TC27（pTM5，Ptac-msiR*）涂布于含有鏈霉素、壯觀霉素、慶大霉素、卡那霉素的固體TY培養基，28℃條件下培養4 d，挑取紅色菌落并接種至液體培養基中進行活化，然后分別轉接至含誘導物刀豆氨酸以及不含刀豆氨酸的液體培養基中，28℃培養4d，吸取200μL的新鮮菌液加入到96孔黑色熒光板中，使用連續波長酶標儀檢測mCherry熒光值，激發光波長為587 nm，吸收光波長為610 nm，同時檢測OD600nm值，收集數據進行分析。

2　結果與分析

2.1構建符合篩選需求的篩選菌株

本研究中構建了含雙篩選系統的篩選菌株，實現了抗性和熒光雙篩選，可以有效地去除單一篩選帶來的假陽性。菌株TC27構建的示意圖見圖1。由圖1可知，Ptac-msiR*表達MsiR突變蛋白（MsiR*），MsiR*突變蛋白可以結合在PmsiA上，刀豆氨酸為誘導物；當MsiR突變為組成型蛋白時，不需要刀豆氨酸誘導即可啟動PmsiA下游基因（卡那抗性基因和mCherry熒光基因）的表達，在含卡那霉素的平板上形成肉眼可見的紅色菌落。

圖1　篩選菌株TC27(pTM5，Ptac-msiR*)示意圖Fig.1　Schematic diagram of screened strain TC27(pTM5，Ptac-msiR*)

為了驗證篩選菌株的可行性，將含野生型msiR基因的表達載體pTCV151以及空載體pYC12通過結合轉移分別轉入篩選菌株中。將含有pTCV151以及空載體pYC12的篩選菌株分別在TY含鏈霉素、壯觀霉素、慶大霉素、卡那霉素以及TY含鏈霉素、壯觀霉素、慶大霉素、卡那霉素、終質量濃度為10 mg/L的刀豆氨酸的液體條件下培養4 d后檢測菌體的OD600nm值，結果見圖2。由圖2a所示，含有質粒pTCV151的篩選菌株在有刀豆氨酸時的OD600nm為0.8，在沒有刀豆氨酸誘導時，菌體的OD600nm只有0.1，含有空載體pYC12的篩選菌株無論是在有或者沒有刀豆氨酸的條件下，菌體的OD600nm都只有0.1左右，這說明篩選菌株在野生MsiR蛋白以及刀豆氨酸同時存在時，才可以啟動卡那抗性基因的表達，菌體在有卡那抗性的培養基中才可以生長。

同樣，將含有pTCV151以及空載體pYC12的篩選菌株分別在TY含鏈霉素、壯觀霉素、慶大霉素以及TY含鏈霉素、壯觀霉素、慶大霉素、終質量濃度為10 mg/L的刀豆氨酸的液體培養基條件下培養4 d，檢測菌體的熒光值；由圖2b所示，含有質粒pTCV151的篩選菌株在有刀豆氨酸時的mCherry熒光值為520左右，在沒有刀豆氨酸誘導時的熒光值僅為120左右，含有空載體pYC12的篩選菌株無論在有或是沒有刀豆氨酸誘導的情況下菌體的熒光值都只有120左右，處于本底表達水平，這說明篩選菌株在有MsiR蛋白以及刀豆氨酸誘導時，mCherry基因才可以表達并產生紅色熒光。綜上所述，篩選菌株只有在轉錄調控蛋白—MsiR蛋白以及誘導物—刀豆氨酸同時存在時才可以啟動卡那抗性基因以及mCherry基因的表達，菌體才可以生長并可以產生紅色熒光。

圖2　驗證篩選菌株的OD600nm值(a)以及mCherry熒光值(b)Fig.2　OD600nmvalue(a)andmCherryfluorescence intensity value(b)of screened strain

2.2分離鑒定MsiR組成型突變蛋白

將含有MsiR突變文庫的篩選菌株在TY（鏈霉素、壯觀霉素、慶大霉素、卡那霉素）的平板上涂布進行初篩，挑取紅色菌落在含刀豆氨酸以及不含刀豆氨酸的液體培養基中培養并檢測突變株的熒光強度，挑選了22株組成型表達的突變株，提取質粒并測序，經分析得到7個不同的MsiR組成型表達的突變蛋白。突變位點對應的氨基酸變化情況，出現的頻率、突變位置以及可能影響的功能見表1，不同組成型突變蛋白的熒光強度見圖3。

表1　組成型突變蛋白中氨基酸突變位置及頻率統計Table 1　Mutation location of amino acids and frequency in constitutive mutant protein

圖3　不同突變蛋白的熒光強度Fig.3　Fluorescence intensity of different mutant proteins

L166P、A147V、P83L、A278T突變蛋白在沒有刀豆氨酸時，其熒光強度約是野生型的6倍，在有小分子——刀豆氨酸時，并沒有表現出進一步的誘導作用，但熒光強度卻是野生型在相同誘導條件下的1.5倍；A147T、E59G、R160C突變在不含刀豆氨酸時，其熒光強度與野生型蛋白在有刀豆氨酸誘導時的熒光強度相近，刀豆氨酸對R160C突變蛋白同樣沒有影響，但是對A174T、E59G這兩個突變蛋白有明顯的誘導作用，其熒光強度是原來的1.7倍；這說明這兩種類型的組成型突變蛋白并沒有完全失去響應誘導物的能力。

2.3MsiR組成型突變位點主要位于MsiR蛋白的C端以及linker區

圖4　MsiR蛋白結構模型Fig.4　Structure model of MsiR protein

通過蛋白同源建模得到MsiR蛋白的結構模型，將這些組成型表達的突變位點標注在模型上，由圖4可以發現，突變位點大多位于C端以及linker上。E59、P83氨基酸殘基位于linker上，linker區是LysR家族蛋白形成四聚體的寡聚化區之一。各突變位點具體分布以及其可能影響的功能情況見表1。因此，E59G以及P83L組成型突變蛋白可能影響了蛋白的寡聚化狀態；A147、L166P氨基酸殘基位于MsiR蛋白C端結構域，該結構域主要負責與小分子的結合，因此，A147V、A147T以及L166P組成型突變蛋白可能影響了蛋白與小分子的結合，使蛋白不需要小分子便可以形成具有活性的構象激活轉錄；R160氨基酸殘基雖然也位于MsiR蛋白C端結構域，但是該氨基酸的側鏈是伸向于結合口袋的外側，并不直接參與和小分子的互作，因此推斷R160C突變蛋白可能是影響了蛋白與小分子作用信號的傳遞；A278氨基酸殘基位于MsiR蛋白C端結構域的loop上，可能會與蛋白linker或C端結構域的某些氨基酸發生作用，影響蛋白的寡聚化狀態或者信號響應。

3　結論

一直以來，對于LysR家族蛋白的研究都側重挖掘出轉錄調控蛋白與目的DNA之間的作用機理以及小分子在DNA與蛋白的互作過程中起到的關鍵性的作用；組成型突變蛋白在不存在小分子的情況下便可以激活轉錄，這可能是由于蛋白發生組成型突變時，改變了蛋白的構象或者改變了蛋白的寡聚化狀態，使蛋白保持激活誘導的；也有報道指出，組成型突變蛋白與DNA結合后改變了DNA的彎折角度，使其處于持續轉錄的狀態。

本研究通過構建MsiR突變文庫以及含雙篩選系統的篩選菌株，利用mCherry報告基因方便，快捷，光穩定性強的特點實現了高通量篩選；通過篩選得到了7株組成型突變株，通過測序確定這7個突變株的突變位點，通過蛋白同源建模分析了這些突變位點的位置以及可能影響的功能，豐富了對MsiR轉錄調控蛋白與DNA以及小分子——刀豆氨酸作用機理的理解，為LysR家族蛋白的調控機理研究提供了新思路。

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Screening of MsiR constitutive mutants fromMesorhizobium tianshanense

ZHAO Yaqi1,2,MA Teng1,2,CAI Tao2*
(1.Tianjin University of Science&Technology,Tianjin 300222,China;2.Tianjin Institute of Industrial Biotechnology, Chinese Academy of Sciences,Tianjin 300308,China)

MsiR protein,derived fromMesorhizobium tianshanense,is one of LysR-type transcriptional regulators(LTTRs),which can activate transcription of themsiAgene in response to anti-metabolite canavanine released by host plant licorice.By building MsiR mutant library,seven MsiR mutants were screened,the mutant protein of L166P,A147V,P83L,A278T lost response to canavanine,and the fluorescence intersity were about 800 without canavanine.While constitutive mutants A147T and E59G can still be induced by canavanine,the fluorescence intonsity of the mutants with canavanine were 1.7 times of the ones without canavanine.Through the distribution of the mutated amino acid residues in MsiR protein and their possible functions through protein homology modeling,the research for MsiR consititutive mutants may provide inspiration to uncovering regulatory mechanism of LTTRs.

LysR-type transcriptional regulator;MsiR protein;constitutive mutant;mCherryreporter gene

Q819

0254-5071（2016）10-0130-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.10.029

2016-05-04

趙亞琪（1991-），女，碩士研究生，主要從事轉錄調控蛋白相關方面的研究工作。

蔡韜（1982-），男，副研究員，博士，主要從事轉錄調控蛋白相關方面的研究工作。