幾種豆科植物抗菌肽的生物信息學預測與分析

鄒謀勇，朱新貴*

（李錦記（新會）食品有限公司，廣東江門529100）

幾種豆科植物抗菌肽的生物信息學預測與分析

鄒謀勇，朱新貴*

（李錦記（新會）食品有限公司，廣東江門529100）

植物抗菌肽是存在于植物組織細胞中的一類對于對外來侵害有防御作用的小分子蛋白，可抑制或殺傷多種細菌和真菌。隨著人們健康意識的提高以及技術手段的進步，植物來源抗菌肽的發掘和應用逐漸成為食品開發領域的重要研究方向。該試驗從蛋白數據庫中篩選了7種豆科植物的抗菌肽，并對其蛋白序列進行了比對和系統進化樹分析，結合生物信息學研究工具對豆科植物抗菌肽的疏水性、拓撲結構域、蛋白空間結構和亞細胞定位進行了預測和分析。結果表明，7種豆科植物抗菌肽序列相似度達到71.94%，均具有8個半胱氨酸保守位點；豆科植物抗菌肽為堿性膜結合蛋白，分布于液泡膜、細胞核膜或者細胞膜上；其3D結構均由一組β-折疊和一個α-螺旋組成，與硫堇、植物防衛素蛋白結構相似。

豆科植物；植物抗菌肽；生物信息學；預測

抗菌肽是一種廣泛存在于生物體內，對生物體相應病原體具有抑制或者殺傷效應的小分子多肽。目前已經從植物、哺乳動物、水生動物、昆蟲、細菌中發現抗菌肽[1-2]，并已累計發現2 000種以上[3]。近年來，對于抗菌肽的研究日益深入，特別是在食品防腐[4]和動物免疫調節[5-6]方面涌現了系列研究成果。植物抗菌肽是抗菌肽家族的重要組成部分，已報道的植物抗菌肽有硫堇、植物防衛素、脂轉移蛋白、幾丁質結合蛋白四類抗菌肽[7-8]，現階段得到公認的作用機制包括4種模型：桶-板模型、毯式模型、環孔模型和凝聚模型，大部分抗菌肽是通過破壞細胞膜來實現其抗菌活性的[9-10]。不同植物合成不同種類的抗菌肽，其作用機制也不盡相同[11]。

豆科植物種子是人類食物和動物飼料的重要植物蛋白質來源，特別是大豆種子的蛋白質占干質量40%以上[12]，其在豆制食品（如豆油、豆奶、豆腐、豆干、豆漿）以及發酵調味食品（如醬油、醬料、腐乳等）中扮演重要角色。隨著經濟社會不斷進步，人們對食品的質量安全要求日益提高，促使食品研究工作者致力于綠色、零添加、天然、健康的食品開發。植物抗菌肽作為來源于植物的抗菌物質，其在食品健康領域的應用前景非常廣闊[13-14]。豆科植物抗菌肽的發掘與分析，對于研究豆科植物自帶蛋白對調味食品發酵微生物的影響以及對豆科植物抗菌肽的分離提取和應用有重要意義。然而，豆科植物抗菌肽的研究卻鮮有研究報道[15-16]。

生物信息學是以數據庫龐大數據信息為基礎，采用計算機信息處理手段解決遺傳數據挖掘、生物進化、分子模擬、藥物設計等重要課題[17]。本研究通過生物信息學對豆科植物的抗菌肽進行了序列比對、系統進化樹分析，并對其理化特性、信號肽、拓撲結構域、蛋白空間結構和亞細胞結構定位進行了初步預測和分析。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

豆科植物抗菌肽蛋白序列來源于Uniprot數據庫。采用豇豆抗菌蛋白序列[18]，在Uniprot數據庫中進行檢索，選取序列相似度達到51.2%以上且來源于豆科植物的蛋白序列進行進一步生物信息學分析。

1.2儀器與設備

生物信息學數據采用ThinkPadE40（0578B31）計算機進行分析，所用生物信息學軟件：ClustalX，DNAMAN，Mega4，PyMOL，Endnote；其他數據均采用在線工具進行分析。

1.3試驗方法

1.3.1豆科植物抗菌肽多重序列比對

采用Clustal X[19]軟件對豆科植物抗菌肽同源序列進行多重比對，并導入DNAMAN軟件進行數據整理和輸出。

1.3.2豆科植物抗菌肽系統進化樹分析

將Clustal X多重序列比對結果導入Mega 4軟件[20]，采用鄰接法構建系統進化樹。Bootstrap值設為1 000，其他參數為默認值。

1.3.3豆科植物抗菌肽生物信息學分析

豆科植物抗菌肽基本理化特性采用蛋白理化特性采用在線工具ProtParam進行分析。抗菌肽信號肽與拓撲結構域分析采用在線分析工具Phobius進行預測。蛋白空間結構采用SWISS-MODEL的自動模式進行同源模建，從數據庫中比對篩選相似度最高的蛋白結構作為同源模建模板。蛋白亞細胞結構定位采用在線工具Plant-mPLoc進行預測。

理化特性中總平均疏水度（grandaverage ofhydropathy，GRAVY）為蛋白序列中所有氨基酸疏水值的總和與氨基酸數量的比值，負值越小表示親水性越好，正值越大表示疏水性越強。

2　結果與分析

2.1豆科植物抗菌肽多重序列比對

從Uniprot數據庫檢索到來源于7種豆科植物的抗菌肽序列，多重序列比對結果如圖1所示，序列相似度達到了71.94%，完全一致的保守氨基酸20個，其中半胱氨酸保守位點8個，可形成4個二硫鍵，以保持蛋白三級結構的相對穩定。FRANCO O L等[18]對不同植物來源的硫堇（Cp-thionin II）進行了多重序列比對，其主要保守位點與圖1顯示的保守氨基酸位點基本一致。GARCíA-OLMEDO F等[21]分析認為植物抗菌肽硫堇具有5種不同的二硫鍵結合方式，植物防衛素有一種保守的二硫鍵結合方式（見圖2A），豆科植物抗菌肽有4個保守二硫鍵，空間分布與已報道的植物防衛素（defensin）高度相似，與硫堇I、II型（見圖2B）也有一定的相似性。因此從蛋白質氨基酸序列的保守性以及二硫鍵的結合方式可以推測來自于7種豆科植物的抗菌肽為硫堇或植物防衛素的相似蛋白。

圖17　種豆科植物抗菌肽多重序列比對結果Fig.1　Multiple alignment of antimicrobial peptides from seven kinds of leguminous plants

圖2　硫堇I、II型二硫鍵結合方式(A)和植物防衛素二硫鍵結合方式(B)Fig.2　Disulfide bridge structures of thionin I,II types(A), disulfide bridge structures of plant defensins(B)

2.2豆科植物抗菌肽系統進化分析

由圖3可知，赤小豆（Phaseolus angularis）和紅豆變種（Vigna angularisvar.angularis）的抗菌肽聚為一支，其親緣關系較近；那卡豆（Vignanakashimae）和綠豆（Vignaradiata）的抗菌肽聚為一支；豇豆（Vigna unguiculata）和上述4種豆科植物的抗菌肽聚為一支。野生大豆（Glycine soja）和大豆（Glycine max）抗菌肽聚為一支，與上述5種豆科植物存在一定的進化距離。但是從整體的進化距離分析，7種不同豆科植物的抗菌肽的親緣關系相對較近。

圖3　7種豆科植物抗菌肽系統進化樹分析Fig.3　Phylogenetic tree analysis of antimicrobial peptides from seven kinds of leguminous plants

2.3豆科植物抗菌肽理化特性分析

采用在線工具ProtParam對7種豆科植物的抗菌肽蛋白進行理化特性分析，統計結果如表1所示。由表1可知，抗菌肽蛋白分子質量在4.29～6.23u之間，分子大小接近；蛋白等電點（isoelectric point，pI）在8.74以上，大豆和野生大豆的pI較高，分別為9.37和9.54，說明豆科植物抗菌肽均帶有一定量的負電荷，為堿性蛋白質。這一結果對后續豆科植物抗菌肽分離純化方法優化（如等電點沉淀）和應用對象的pH值環境設定有重要指導意義。抗菌肽平均疏水度＜-0.439，最小平均疏水度為-0.706（紅豆變種、赤小豆），從疏水度數值特征分析認為7種豆科植物具有一定的親水性；這一特性使得其可以在絕大部分以水為溶劑的飲料食品或者含水的固體半固體食品中發揮抑菌、殺菌活性，表明其在食品保鮮方面具有較大的應用空間。

表17　種豆科植物抗菌肽的理化特性預測Table 1　Physicochemical properties prediction of antimicrobial peptides from seven kinds of leguminous plants

2.4幾種豆科植物抗菌肽的信號肽與拓撲結構分析

在線分析工具Phobius預測結果如表2所示，赤小豆、紅豆、綠豆和那卡豆的信號肽長度相等，氨基酸序列僅有一個位點差異，進一步證實了豆科植物蛋白在進化上的保守性。拓撲結構域分析表明7種豆科植物抗菌肽成熟肽段均為非胞質結構域，結合非胞質結構域的定義和蛋白疏水性分析結果（表1），推斷豆科植物抗菌肽為膜結合蛋白。因此在進行豆科植物抗菌肽提取時應當優先考慮將胞質和膜結構分開，進而從膜結構中分離目標蛋白，提高蛋白提取效率。為了更大量獲得豆科植物抗菌肽，需從分子生物學角度提高生物反應器目標蛋白的合成量，通過信號肽序列改造或置換實現其穿膜運輸，使其分泌到培養液中，以降低后續分離提取難度。

2.5豆科植物抗菌肽3D結構同源模建

表27　種豆科植物抗菌肽的信號肽與拓撲結構分析Table 2　Signal peptide and topological structure of antimicrobial peptides from seven kinds of leguminous plants

由表3可知，大豆和野生大豆抗菌肽與模板硫堇（γ-1-p thionin）的序列相似度為46.81%。綠豆和那卡豆與模板植物防御素（plant defensin）的序列相似度達到100.00%，即可以鑒定為同一蛋白。紅豆變種和赤小豆與模板植物防御素的序列相似度為78.26%，豇豆抗菌肽與模板植物防御素的序列相似度為73.91%，可以推斷這3種植物抗菌肽與植物防御素高度同源。抗菌肽蛋白和模板相似度的比對結果與系統進化樹分析（圖3）所示的同源聚類情況基本一致，推測大豆與野生大豆抗菌肽進化方向為硫堇，與其他5種豆科植物的同源蛋白（植物防御素）雖然有較高的序列相似性，但進化方向出現了明顯的分支。

表37　種豆科植物抗菌肽同源模建模板Table 3　Homology modeling templates of antimicrobial peptides from seven kinds of leguminous plants

以表3所列蛋白作為模板，采用SWISS-MODEL對豆科植物抗菌肽進行同源模建，繪制蛋白3D圖像如圖4所示，7種蛋白具有相似的3D結構，均由一組β-折疊和一個α-螺旋組成，大豆抗菌肽和野生大豆抗菌肽空間結構上非常接近，另外5種抗菌肽蛋白空間結構相似性較高。圖4（C、D、E、F、G）所示5種植物抗菌肽的空間結構與BROEKAERT W F等[24]展示的植物防御素（Rs-AFP1）非常相近，Rs-AFP1來自于十字花科蘿卜種子。結合系統進化樹、序列相似度和蛋白3D結構分析，推斷豆科植物中存在與植物防御素、硫堇蛋白序列空間結構相似的蛋白質，這類蛋白可能參與了豆科植物抵御病原微生物入侵的生理過程，即為抗菌肽。從空間結構上解析豆科植物抗菌肽，為后續抗菌肽晶體結構解析，蛋白活性位點改造和蛋白穩定性分子改造提供了重要數據基礎，同時也為抗菌肽殺菌機制的研究提供了理論參考。

圖4　7種豆科植物抗菌肽蛋白的同源模建3D圖Fig.4　3D homology modeling of antimicrobial peptides from seven kinds of leguminous plants

2.6豆科植物抗菌肽亞細胞結構定位

采用在線工具Plant-mPLoc對幾種豆科植物的抗菌肽進行亞細胞結構定位，結果如表4所示。由表4可知，大豆、赤小豆抗菌肽定位于液泡，野生大豆的抗菌肽定位于細胞核和液泡，紅豆變種的抗菌肽定位于細胞核，綠豆和那卡豆的抗菌肽定位于細胞膜和細胞核。結合7種豆科植物抗菌肽的拓撲結構分析，推斷抗菌肽位于上述亞細胞結構的膜上。這一結果對于研究植物抗菌肽殺菌機制的進化過程以及建立豆科植物抗菌肽分離提取方案具有參考意義。汪少蕓等[16]從豆科植物入手，研究了植物、動物的防御蛋白及其進化趨勢，驗證了生物功能分子效率與進化趨勢相關聯的理論。董璐[15]從脫脂大豆中提取了大豆球蛋白堿性抗菌肽（glycinin basic antibacterial peptide，GBAP），并研究了GBAP對大腸桿菌細胞膜的影響，驗證了GBAP對冷藏鮮肉中微生物的抑制作用；堿性抗菌肽的提取進一步證實了生物信息學工具預測大豆抗菌肽為堿性蛋白質的準確性。這一研究表明大豆抗菌肽在食品保鮮有重要應用前景，也提示大豆抗菌肽的存在對于以大豆為主要原料的調味食品發酵有重要影響，需要關注發酵過程中大豆抗菌肽含量和性質變化，并評估對發酵微生物生長代謝的影響。

表47　種豆科植物抗菌肽亞細胞結構定位Table 4　Subcellular structure localization of antimicrobial peptides from seven kinds of leguminous plants

3　結論

7種豆科植物的抗菌肽序列相似度為71.49%，具有20個完全一致的氨基酸保守位點；系統進化樹分析表明7種不同豆科植物抗菌肽的親緣關系較近。蛋白理化性質分析表明7種豆科植物均為堿性蛋白質，具有一定的親水性；拓撲結構分析預測抗菌肽成熟肽段均為非胞質結構域，推測抗菌肽為膜結合蛋白；同源模建表明豆科植物抗菌肽3D結構與硫堇、植物防衛素蛋白結構相似；通過亞細胞結構定位分析認為，7種豆科植物抗菌肽定位于液泡膜、細胞核膜或者細胞膜上，不同種豆科植物的亞細胞結構定位存在差異。豆科植物抗菌肽的序列分析和生物信息學預測為進一步研究豆科植物抗菌肽的分離提取、生理生化性質研究，及其在食品保鮮和食品發酵領域的應用提供了數據基礎。

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Bioinformatics prediction and analysis of antimicrobial peptides from leguminous plants

ZOU Mouyong,ZHU Xingui*
(Lee Kum Kee(Xinhui)Foods Co.,Ltd.,Jiangmen 529100,China)

Plant antimicrobial peptides,existing in plant tissue and cell,are micromolecule proteins for resisting foreign invasion.They have the capacity of resisting and killing a variety of bacterium and fungi.With the improvement of health consciousness and advance of technology,exploring and application of plant antimicrobial peptides become an important research aspect in the field of food development.In the test,seven antimicrobial peptides of leguminous plants were screened from protein database,and multiple alignment and phylogenetic tree analysis were conducted.The hydrophobicity,topologicaldomain,protein 3D structure,subcellular structure localization of plant antimicrobial peptides were predicted and analyzed by bioinformatics tools.It showed that the similarity of antimicrobial peptides sequence of seven leguminous plants,which had eight conserved sites of cysteines,was 71.94%.They were alkaline membrane binding proteins which distributed on tonoplast,nuclear membrane or cytomembrane.The 3D structures were constituted by a group of β-sheets and a α-helix,and the structure similarity was found among thionin,plant defensin.

leguminous plant;plant antimicrobial peptides;bioinformatics;prediction

TS202.1

0254-5071（2016）10-0135-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.10.030

2016-06-18

鄒謀勇（1987-），男，碩士研究生，研究方向為調味品發酵技術與產品開發。

朱新貴（1967-），男，博士，副教授，研究方向為調味品科學與技術。