全酶解法提取杜仲葉中綠原酸及其含量測(cè)定

張雪梅，謝金芮，陳玉甫，張學(xué)俊*

（1.貴州大學(xué)貴州省發(fā)酵工程及生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽(yáng)550025；2.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州貴陽(yáng)550025；3.貴州大學(xué)藥學(xué)院，貴州貴陽(yáng)550025）

全酶解法提取杜仲葉中綠原酸及其含量測(cè)定

張雪梅1，2，謝金芮3，陳玉甫1，2，張學(xué)俊1，2*

（1.貴州大學(xué)貴州省發(fā)酵工程及生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽(yáng)550025；2.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州貴陽(yáng)550025；3.貴州大學(xué)藥學(xué)院，貴州貴陽(yáng)550025）

采用酸性蛋白酶、果膠酶和纖維素酶分步酶解提取杜仲葉中的綠原酸，并經(jīng)高效液相色譜(HPLC)法測(cè)定其中的綠原酸含量。杜仲葉經(jīng)過(guò)酸性蛋白酶、果膠酶、纖維素酶的分步連續(xù)酶解后，測(cè)得杜仲粉樣品中的綠原酸總含量可達(dá)到61.8 μg/g，其中酸性蛋白酶、果膠酶和纖維素酶提取杜仲粉中綠原酸含量分別為26.4 μg/g、20.5 μg/g、14.9 μg/g，明顯高于水提法(12.2 μg/g)。

杜仲葉；綠原酸；酶解；高效液相色譜法

杜仲（Eucommia ulmoidesOlive）也被稱為“絲棉樹(shù)”、“絲棉皮”[1]，是200多萬(wàn)年以前冰川活動(dòng)殘留下來(lái)的一種多年生落葉喬木的古生物樹(shù)種[2]，起源于我國(guó)，已被列入《中國(guó)植物紅皮書稀有瀕危植物》中的二級(jí)珍稀物種[3]。杜仲具有降壓[4]、調(diào)血脂、降血糖、增強(qiáng)免疫力、抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、抗菌、抗病毒、保肝、利膽、利尿等作用[5]。綠原酸（chlorogenic acid）是杜仲具有降壓調(diào)節(jié)作用的重要藥效成分之一[6]，其主要藥效有雙向調(diào)整血壓、抗腫瘤、補(bǔ)腎[7]、改善機(jī)體免疫力、抗氧化、延緩衰老、抗菌、抗病毒等[8]。2005版中國(guó)藥典將綠原酸定為評(píng)估杜仲品質(zhì)好壞的重要技術(shù)參數(shù)[9]。

杜仲天然藥物成分的提取研究一直廣受重視，引起大批學(xué)者的關(guān)注，采用的方法很多，如有機(jī)溶劑提取、乙醇系列濃度提取法、溶劑固相萃取法、超聲提取法[10]、微波提取法以及酶解法等，分離提純的方法有大孔樹(shù)脂分離法[11]、硅膠柱色譜分離法、高速逆流色譜技術(shù)[12]等。蘭小艷等[13]采用正交試驗(yàn)確定了乙醇法提取杜仲葉中綠原酸的最佳工藝條件。冉琴琴等[14]采用角質(zhì)酶破壞寄主植物中起保護(hù)作用的角質(zhì)層，再通過(guò)蛋白酶、果膠酶和纖維素酶處理，可以更好提取杜仲葉中的綠原酸。

杜仲葉與杜仲樹(shù)皮相比簡(jiǎn)便、大量、易得，而且綠原酸等含量高于杜仲皮且多分布于云、貴、川地區(qū)[15]。實(shí)驗(yàn)采取多種生物酶，對(duì)杜仲葉進(jìn)行全酶解，首先用酸性蛋白酶去除蛋白質(zhì)組分，再用果膠酶與纖維素酶降解表層與黏連角質(zhì)層的果膠質(zhì)和粘連植物細(xì)胞壁的果膠質(zhì)，降解分散植物細(xì)胞壁。采用酸性蛋白酶、果膠酶和纖維素酶聯(lián)合酶促降解提取杜仲葉中的化學(xué)成分，并經(jīng)高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法測(cè)定其中的綠原酸含量，從而達(dá)到對(duì)杜仲葉的全酶降解，實(shí)現(xiàn)有效成分的提取。深入探索杜仲資源的開(kāi)發(fā)，以期增強(qiáng)我國(guó)中草藥在國(guó)際舞臺(tái)上的競(jìng)爭(zhēng)力，加速中草藥的國(guó)際化進(jìn)程。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

杜仲葉：貴州省遵義市遵義縣新舟鎮(zhèn)金仲村；酸性蛋白酶（5萬(wàn)U/g）、果膠酶（5萬(wàn)U/g）、纖維素酶（5萬(wàn)U/g）：張家港市金源生物化工有限公司；β-環(huán)糊精（生化試劑）、異丙醇（色譜純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；檸檬酸（純度為99%）、檸檬酸鈉（純度為99%）：濰坊英軒實(shí)業(yè)有限公司；無(wú)水乙醇、磷酸（均為分析純）：天津市富宇精細(xì)化工有限公司；乙腈（色譜純）：美國(guó)Tedia公司；綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度為98%）：阿拉丁試劑（上海）試劑有限公司；超純水為實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2儀器與設(shè)備

Agilent1260高效液相色譜儀：美國(guó)安捷倫公司；FA2004B電子天平：沈陽(yáng)龍騰電子科技有限公司；UV-2550紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：日本島津公司；SHA-CA數(shù)顯水浴恒溫振蕩器：常州普天儀器制造有限公司；EYELA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海愛(ài)朗儀器有限公司；XW-80A漩渦混合儀：海門市其林貝爾儀器制造有限公司；0.45μm微孔濾膜：上海興亞凈化材料廠；B01145AA貝克曼離心機(jī)：貝克曼庫(kù)爾特商貿(mào)（中國(guó)）有限公司；SZ-96A自動(dòng)純水蒸餾器：上海亞榮生化儀器廠。

1.3方法

1.3.1酶制劑的制作

（1）酸性蛋白酶制劑：酸性蛋白酶最適pH值為3.4，準(zhǔn)確稱量33.62 g檸檬酸與11.77 g檸檬酸鈉，蒸餾水溶解并定容至2 000 mL。分4次與10 g酸性蛋白酶混合，合并收集4次洗脫液制成酸性蛋白酶液。

（2）果膠酶制劑：果膠酶最適pH為3.6，準(zhǔn)確稱量31.30 g檸檬酸與15.00 g檸檬酸鈉，蒸餾水溶解并定容至2 000 mL。分4次與10 g果膠酶混合，合并收集4次洗脫液制成果膠酶液。

（3）纖維素酶制劑：纖維素酶最適pH為5，準(zhǔn)確稱量17.23 g檸檬酸與34.71 g檸檬酸鈉，蒸餾水溶解并定容至2 000 mL。分4次與10 g纖維素酶混合，合并收集4次洗脫液制成纖維素酶液。

1.3.2樣品處理方法

杜仲葉酶解工藝流程：

水提取：在編號(hào)為1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)和4號(hào)的4個(gè)1 000 mL三角瓶中分別加入50.0 g經(jīng)小心揉碎成團(tuán)（杜仲葉中含杜仲膠，揉碎后自動(dòng)成團(tuán)）且無(wú)損失的杜仲葉，加入500 mL蒸餾水，搖勻后置于50℃水浴床，180 r/min振蕩8.0 h后取出，合并收集并抽濾，將濾液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮至100mL，加入無(wú)水乙醇400 mL至整個(gè)酶解液體系中的乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%，混合充分后靜置沉淀過(guò)夜。將經(jīng)乙醇沉淀處理的水解液上清液與β-環(huán)糊精以8∶1（mL∶g）的比例充分混合均勻，將混合溶液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（45℃、60 r/min）蒸干呈塊狀后粉碎，即為水提杜仲粉。

酸性蛋白酶提取：取編號(hào)為1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)和4號(hào)的4個(gè)1 000 mL三角瓶，分別加入50.0 g經(jīng)小心揉碎，加入500 mL酸性蛋白酶制劑，置于55℃水浴搖床，180 r/min振蕩8.0 h后取出，合并收集濾液并抽濾，將濾液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮至100 mL，加入無(wú)水乙醇400 mL至整個(gè)酶解液體系中乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%，劇烈振蕩混合充分后靜置沉淀過(guò)夜，稱取50 gβ-環(huán)糊精，將經(jīng)乙醇沉淀的蛋白酶酶解液上清液與β-環(huán)糊精以8∶1（mL∶g）的比例充分混合均勻后，將混合溶液置于（45℃、60r/min）旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干呈塊狀后，粉碎，即為酸性蛋白酶提取杜仲粉。

果膠酶提取：收集蛋白酶酶解后各個(gè)三角瓶中所有杜仲葉殘余固體繼續(xù)進(jìn)行果膠酶酶解。加入果膠酶制劑后后續(xù)處理，過(guò)程同蛋白酶酶解，即可得果膠酶提取杜仲粉。

纖維素酶提取：收集果膠酶酶解后各個(gè)三角瓶中所有杜仲葉殘余固體繼續(xù)進(jìn)行纖維素酶酶解。加入纖維素酶制劑后后續(xù)處理過(guò)程同酸性蛋白酶酶解一致，即可得纖維素酶提取杜仲粉。

精密稱取水提杜仲粉、酸性蛋白酶提取杜仲粉、果膠酶提取杜仲粉以及纖維素酶提取杜仲粉各0.1 g于1.5 mL離心管中，分別加入1.5 mL體積分?jǐn)?shù)95%乙腈溶液溶解，于漩渦混合儀上充分混勻，經(jīng)4℃，10 000 r/min離心20 min，取上清液經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾并轉(zhuǎn)移至樣品瓶中待測(cè)。

1.3.3綠原酸檢測(cè)方法

采用高效液相色譜法檢測(cè)樣品中綠原酸的含量。色譜柱為TOSOHTSKgelODS-100Z（5 μm×4.6 mm×250 nm），流動(dòng)相A（0.4%磷酸水溶液）∶B（乙腈）=9∶91（V/V），檢測(cè)波長(zhǎng)324 nm，流速0.6 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，柱溫40℃。

綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：精密稱取綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品10.0mg，用體積分?jǐn)?shù)為95%的乙腈溶液溶解，定容至100 mL，得質(zhì)量濃度為0.1mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，分別量取1.25mL、2.50mL、3.75 mL、5.00 mL、6.25 mL的0.4 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，并定容至10 mL，配制成質(zhì)量濃度分別為0.05 mg/mL、0.10 mg/mL、0.15 mg/mL、0.20 mg/mL、0.25 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，所得溶液用0.45 μm濾膜過(guò)濾。分別吸取10 μL配制好的綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液注入高效液相色譜儀中，按照上述色譜條件測(cè)定峰面積，并以綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，峰面積（y）為縱坐標(biāo)繪制綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2　結(jié)果與分析

2.1綠原酸檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

準(zhǔn)確稱取綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg，用體積分?jǐn)?shù)為95%的乙腈溶液溶解并定容至100 mL棕色容量瓶中，充分混勻，以超純水作對(duì)比，在波長(zhǎng)為200～500 nm范圍內(nèi)掃描，結(jié)果如圖1所示。

圖1　綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品紫外吸收光譜Fig.1　Ultraviolet absorption spectrum of chlorogenic acid standard substance

由圖1可知，綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品在波長(zhǎng)324 nm處有最大吸收峰，故選擇324 nm為檢測(cè)綠原酸的最佳波長(zhǎng)。

2.2綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品及樣品高效液相色譜分析

綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品高效液相色譜圖如圖2所示，杜仲葉水解液和3種酶解液高效液相色譜圖如圖3所示。

圖2　綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品HPLC色譜圖Fig.2　HPLC chromatograms of chlorogenic acid standard substance

由圖2可知，綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間為3.806 min，峰形較尖銳，較窄，吸收相對(duì)較好。由圖3可知，水提杜仲粉、蛋白酶杜仲粉、果膠酶杜仲粉、纖維素酶杜仲粉在設(shè)定的色譜條件下均在3.8～4.0 min左右出現(xiàn)最大吸收峰，保留時(shí)間和綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間十分相近，可以判定其中均含有綠原酸。綠原酸在每步酶解時(shí)所占的比例并不是都很高，均不同程度的有其他雜峰出現(xiàn)，由此推斷還有其他組分存在，也同時(shí)說(shuō)明經(jīng)酸性蛋白酶、果膠酶、纖維素酶連續(xù)分步酶解后可以使有效成分一并溶出。

圖3　杜仲葉水解液(a)、酸性蛋白酶酶解液(b)、果膠酶酶解解液(c)和纖維素酶解液(d)HPLC色譜圖Fig.3　HPLC chromatograms of hydrolysate(a),acid protease enzymolysis liquid(b),pectinase enzymolysis liquid(c) and cellulose enzymolysis liquid(d)of folium cortex eucommiae

2.3綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，峰面積（y）為縱坐標(biāo)繪制綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4　綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4　Standard curve of chlorogenic acid

由圖4可知，由綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線求得標(biāo)準(zhǔn)線性回歸方程為：y=552.20x-117.13，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 2，表明兩者線性關(guān)系良好，可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)線性回歸方程計(jì)算各杜仲粉樣品中綠原酸含量。

2.4杜仲葉中綠原酸含量的檢測(cè)

根據(jù)1.3.3中的方法及2.3中的標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)得的水、蛋白酶、果膠酶和纖維素酶提取杜仲粉中的綠原酸含量如表1所示。

表1　杜仲粉中綠原酸的含量Table 1　Chlorogenic acid contents in folium cortex eucommiae powder

由表1可知，經(jīng)酸性蛋白酶、果膠酶、纖維素酶分別提取后，各步酶解的杜仲粉綠原酸含量分別為26.4 μg/g、20.5μg/g、14.9μg/g，三步酶解的綠原酸總量可達(dá)61.8μg/g，水提杜仲粉中綠原酸含量?jī)H為12.1 μg/g，酶提法提取的綠原酸約為水提法提取的5倍多。隨著酶的加入，提取出綠原酸逐漸減少。酸性蛋白酶處理后提取的綠原酸最多，纖維素酶處理后提取的綠原酸最少，僅有14.9 μg/g，但仍比水提法多2.8 μg/g。說(shuō)明多種酶連續(xù)分步酶解可使杜仲葉中的綠原酸大量溶出。

3　結(jié)論

本研究采用酸性蛋白酶、果膠酶和纖維素酶對(duì)杜仲葉進(jìn)行分步酶解，并采用高效液相色譜法對(duì)其綠原酸的含量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，隨著酶的不斷加入能提取出的物質(zhì)逐漸變少，多種酶分步連續(xù)酶解后對(duì)于提取綠原酸十分有效，能達(dá)到充分提取的效果，經(jīng)純水、酸性蛋白酶、果膠酶和纖維素酶提取杜仲粉中綠原酸含量分別為12.1 μg/g、26.4 μg/g、20.5 μg/g、14.9 μg/g，酸性蛋白酶提取最多，果膠酶次之，纖維素酶最少，但仍然比水提取的綠原酸多2.8μg/g。相較于水提法來(lái)看，酶解法優(yōu)勢(shì)明顯。

傳統(tǒng)中多采用水提法提取中藥草中的藥效成分，長(zhǎng)時(shí)間煎煮不但耗能費(fèi)時(shí)，還會(huì)破壞許多熱敏性的藥效成分。水提法不能將葉中的綠原酸盡可能多的提出，因杜仲葉中的活性物質(zhì)大多存在于細(xì)胞壁包被的葉細(xì)胞內(nèi)，通過(guò)生物酶水解破壞杜仲的葉片結(jié)構(gòu)和細(xì)胞壁使藥效成分加快釋放，充分提取，因此，酶解法提取杜仲中的綠原酸發(fā)展前景十分廣闊。

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Extraction of chlorogenic acid from folium cortex eucommiae by enzymatic hydrolysis method and determination of its content

ZHANG Xuemei1,2,XIE Jinrui3,CHEN Yufu1,2,ZHANG Xuejun1,2*
(1.Guizhou Province Key Laboratory of Fermentation Engineering&Biological Pharmacy,Guizhou University,Guiyang 550025,China; 2.School of Liquor&Food Engineering,Guizhou University,Guiyang 550025,China; 3.School of Pharmaceutical Sciences,Guiyang 550025,China)

The chlorogenic acid from folium cortex eucommiae was extracted by acid protease,pectinase and cellulase,and the content was determined by high performance liquid chromatography(HPLC).After continuous hydrolysis by acid protease,pectinase and cellulase in sequence, the total content of chlorogenic acid from folium cortex eucommiae was up to 61.8 μg/g,and the content of chlorogenic acid extracted by acid protease,pectinase and cellulase were 26.4 μg/g,20.5 μg/g and 14.9 μg/g,respectively,which was significantly higher than that of water extraction (12.2 μg/g).

folium cortex eucommiae;chlorogenic acid;hydrolysis;HPLC

Q55

0254-5071（2016）10-0149-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.10.033

2016-05-19

校正合作項(xiàng)目（筑科合同[2011102]109）

張雪梅（1990-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槲⑸飳W(xué)、天然產(chǎn)物化學(xué)。

張學(xué)俊（1952-），男，教授，博士，研究方向?yàn)榛瘜W(xué)生物學(xué)，酶化學(xué)和天然產(chǎn)物化學(xué)。