超聲-微波協同萃取銀杏葉黃酮與內酯B的工藝研究

吳昊，宗志敏，李秀秀

（1.徐州工業職業技術學院化學工程技術學院，江蘇徐州221140；2.中國礦業大學化工工程學院，江蘇徐州221116）

超聲-微波協同萃取銀杏葉黃酮與內酯B的工藝研究

吳昊1，2，宗志敏2，李秀秀1

（1.徐州工業職業技術學院化學工程技術學院，江蘇徐州221140；2.中國礦業大學化工工程學院，江蘇徐州221116）

研究了超聲-微波協同萃取銀杏葉黃酮與內酯B的最佳工藝條件，以銀杏葉黃酮與內酯B得率為考核指標，探討料液比、提取溫度、乙醇體積分數以及浸提時間等因素對銀杏葉黃酮與內酯B得率的影響，并通過單因素及正交試驗對其提取工藝條件進行了優化。結果表明，最優提取工藝條件為料液比1∶20(g∶mL)，提取溫度50℃，乙醇體積分數為70%和提取時間4 min。在此最佳條件下，銀杏葉黃酮及內酯B的得率分別為2.25%和0.81%。

銀杏葉；黃酮；內酯B；超聲波；微波；提取條件

銀杏（Ginkgo bilobaL.）別名白果、公孫樹，是中生代侏羅紀時期孑遺植物的稀有樹種。銀杏葉來源獲取方便且是銀杏樹的有效活性部位，主要含有豐富的黃酮類化合物和萜內酯類等活性物質，具有抗氧化、抗腫瘤、抗病毒、防治心血管疾病及提高人體免疫能力等功效，銀杏葉化合物已成為熱門的天然產物活性物質研究之一[1-2]。

目前，對銀杏葉活性成分的研究主要集中在某單個活性成分的提取、分離純化及其功效研究等方面，而對于銀杏葉中主要活性成分的同時提取研究較少[3-5]。當前銀杏葉活性成分的提取主要有溶劑提取法、超聲波法、微波法以及超臨界流體萃取法。溶劑提取法的優點是操作簡單、成本低。缺點是有機試劑容易造成環境的污染、且提取耗時長，效率低；超臨界流體萃取的優點是提取效率高、收率大，缺點是設備昂貴、成本高且操作繁瑣；超聲波和微波法是分別利用機械波和電磁波破壞細胞壁結構，將活性成分充分溶出，因而花費時間短，不破壞活性成分，萃取高效，已被廣泛應用于天然活性物質的提取、樣品的預處理和污染物的清洗等方面[6-10]。唐仕榮[11]研究了微波-超聲波協同萃取銀杏黃酮工藝，將微波-超聲波協同萃取方法作為一種原材料的預處理方法，考察了銀杏黃酮這一類化合物組分的提取。

本研究旨在通過超聲-微波協同工藝提取銀杏中黃酮、萜內酯B的主要活性成分，考察料液比、提取溫度、乙醇體積分數、提取時間對銀杏葉黃酮與內酯B得率的影響，優化超聲波-微波協同萃取提取工藝，為銀杏葉資源的綜合利用研究提供試驗依據，對銀杏葉資源的綜合利用開發研究具有重要意義。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

銀杏葉：校園內采集；甲醇、磷酸（均為色譜級）：美國Sigma-Aldrich公司；乙醇、乙酸乙酯、石油醚（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；槲皮素標準品（純度＞98%）、山奈素標準品（純度＞98.5%）、異鼠李素標準品（純度＞98.5%）、銀杏內酯B標準品（純度＞98.5%）：中國藥品生物制品鑒定所。

1.2儀器與設備

Essentia LC-15C高效液相色譜：島津儀器（蘇州）有限公司；ATY124電子天平：日本島津公司；CW-2000超聲波-微波協同萃取儀（超聲波固定功率50W，頻率40kHZ，微波功率可調）：上海新拓分析儀器科技有限公司；UV1901PCS紫外可見分光光度計：上海佑科儀器儀表有限公司；RV 10旋轉蒸發儀：艾卡（廣州）儀器設備有限公司；GL-20B高速冷凍離心機：上海安亭科學儀器廠。

1.3試驗方法

1.3.1銀杏葉的預處理

將銀杏葉在50℃條件下烘干粉碎，過60目篩，加入一定體積分數的乙醇溶液浸泡24 h待用，以有利于后續的超聲微波協同萃取。

1.3.2超聲微波協同萃取工藝

在時間程序下設置微波功率為300 W，微波超聲協同運行40 s（超聲功率50 W及頻率40 kHz），隨后在恒溫程序下設置一定的料液比、溫度、乙醇體積分數、提取時間等因素條件超聲微波協同萃取銀杏葉黃酮與萜內酯B。

1.3.3銀杏葉黃酮含量的測定

將預處理好的銀杏葉，放置于萃取瓶內，加入乙醇溶液，設置一定的條件進行微波超聲協同萃取，提取完畢后，于5 000 r/min條件下離心20 min，取上清液真空旋轉蒸發濃縮至無液體流出，加甲醇-25%鹽酸溶液（4∶1）的混合液25 mL，放置于水浴內加熱回流30 min，而后冷卻至室溫，轉移至50mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，經0.45μm微濾膜過濾，取樣待檢，銀杏葉黃酮含量的測定用高效液相色譜法[12]。色譜條件：Wondasil-C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：甲醇-0.4%磷酸（50∶50，V/V）；流速：1.0mL/min；檢測波長：360 nm；柱溫：30℃；進樣量：20 μL；定量采用外標法。

1.3.4銀杏內酯B含量的測定

銀杏萜內酯類化合物主要有銀杏內酯A、B、C、J和M，均為血小板活化因子（platelet activating factor，PAF）拮抗劑，由于銀杏內酯B對PAF產生的拮抗作用最強，因此本試驗萜內酯類化合物選擇以銀杏內酯B為考察指標。

按1.3.2方法得到的粗提液取樣真空濃縮，干燥粉碎，準確稱量后分散于水中，并加入3倍體積的石油醚萃取，靜置后分層，加入乙醇溶解，濃縮至干[13]。濃縮后物質加入乙酸乙酯，完全溶解后加入NaHCO3，調整pH 8～9，加入HCl調整pH至中性。振蕩混勻后，靜置分層，取上層溶液過濾，取樣濃縮至無液體流出，加甲醇7mL超聲溶解，定容至10mL，經0.45 μm微濾膜過濾，取樣待檢測，銀杏內酯B含量測定用高效液相色譜法[14-15]。色譜條件：Wondasil-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-0.1%磷酸（35∶65， V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：220 nm；柱溫：28℃；進樣量：10 μL；定量采用外標法。

1.3.5標準曲線的繪制

槲皮素、山奈素與異鼠李素：分別精確稱取槲皮素標準品50 mg、山奈素標準品20 mg、異鼠李素標準品20 mg，分別置于100 mL棕色容量瓶中，加入部分甲醇超聲溶解，再定容至刻度線，精密吸取對照品溶液適量，用甲醇分別制成質量濃度為0.01 mg/mL、0.02 mg/mL、0.04 mg/mL、0.08mg/mL、0.10 mg/mL的標準使用液。分別精密吸取各濃度對照溶液20 μL注入高效液相色譜儀，測定峰面積。分別以槲皮素質量濃度、山奈素質量濃度、異鼠李素質量濃度為橫坐標X（mg/mL），峰面積（mAU）為縱坐標Y，繪制標準曲線，得槲皮素線性回歸方程為Y=0.011 9X+0.000 5，相關系數R=0.999 9；山奈素線性回歸方程為Y=0.012 5X-0.000 1，相關系數R=0.999 9；異鼠李素線性回歸方程為Y= 0.010 7X+0.000 3，相關系數R=0.999 9。

銀杏內酯B：精密稱取50 mg的內酯B標準品，用甲醇溶解并定容至10mL容量瓶中，搖勻，分別精密移取2.5 mL、2.0 mL、1.0 mL、0.5 mL標準液，分別轉移至5 mL容量瓶中，加入甲醇定容，搖勻，分別配制成質量濃度為2.5 mg/mL、2.0 mg/mL、1.0 mg/mL、0.5 mg/mL標準品溶液。分別精密吸取各濃度對照溶液10 μL注入高效液相色譜儀，測定峰面積。以銀杏內酯B質量濃度（mg/mL）為橫坐標X，峰面積（mAU）為縱坐標Y，繪制標準曲線，得線性回歸方程為Y=357.59X-3.491 3，相關系數R=0.999 9。

1.3.6提取條件優化單因素試驗

稱取10 g經預處理的銀杏葉粉，按不同料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g∶mL）），加入不同體積分數（40%、50%、60%、70%、80%）乙醇溶液，在不同提取溫度（25℃、35℃、45℃、55℃、65℃），不同提取時間1min、2min、3min、4 min、5 min條件下，分別考察料液比、乙醇體積分數、提取溫度及提取時間對銀杏葉黃酮與內酯B得率的影響。

1.3.7提取條件優化正交試驗

選定超聲-微波協同萃取銀杏黃酮和內酯B工藝中的料液比、提取溫度、乙醇體積分數、提取時間作為考察的4個因素，每個因素各取3個水平，以銀杏黃酮和內酯B的綜合得率為評價指標，采用L9（34）正交設計進行試驗，正交試驗因素水平見表1。

表1　提取條件優化正交試驗因素與水平Table 1　Factors and levels of orthogonal experiments for extraction conditions optimization

1.3.8銀杏葉黃酮、銀杏葉內酯B及綜合得率的計算

總黃酮醇苷質量（mg）=[槲皮素質量（mg）+山奈素質量（mg）+異鼠李素質量（mg）]×2.51[16]

式中：2.51是中國藥典總黃酮醇苷質量計算中的黃酮醇苷

與苷元之間的平均換算因子。

式中：C為測定樣液的質量濃度，mg/mL；N為樣品稀釋倍數；V為樣液濃縮體積，mL；W為樣品質量，g。

權衡銀杏葉中黃酮、內酯B兩類物質對藥理活性的貢獻，設定銀杏葉中黃酮、內酯B得率的權重分別為40%和60%，故綜合得率（%）=銀杏葉黃酮得率×40%＋銀杏葉內酯B得率×60%。

2　結果與分析

2.1料液比對超聲協同微波萃取銀杏葉黃酮與內酯B得率的影響

圖1　料液比對銀杏葉黃酮與內酯B得率的影響Fig.1　Effect of solid-liquid ratio on yield of flavonoids and ginkgolide B fromGinkgo biloba

由圖1可以看出，料液比在1∶10～1∶25（g∶mL）時，銀杏葉黃酮與內酯B得率逐漸增加，并且黃酮的溶出速率高于內酯B，可能是因為銀杏中黃酮的溶解性高于銀杏內酯B；當料液比增加到1∶25（g∶mL）時，黃酮與內酯B得率即達到了較高值，當料液比＞1∶25（g∶mL）時，不僅得率沒有明顯增加，而且不利于后續的離心濃縮操作。因此，料液比為1∶25（g∶mL）為宜。

2.2提取溫度對超聲協同微波萃取銀杏葉黃酮與內酯B得率的影響

由圖2可以看出，提取溫度分別在25～45℃及25～55℃時，隨提取溫度增大銀杏葉黃酮與內酯B得率相應提高，這是因為提取溫度越高，較高的溫度促進活性物質分子的分子運動擴散，有利于銀杏葉黃酮與內酯B的滲出。但在提取溫度分別超過45℃及55℃之后，銀杏葉黃酮與內酯B得率逐漸減小。可能是由于溫度過高，超聲-微波協同瞬間熱效應過于明顯，使得局部溫度過高導致黃酮和內酯成分的破壞，從而影響了銀杏葉黃酮和內酯B的得率；提取溫度分別達到45℃、55℃時，銀杏葉黃酮、銀杏葉內酯B得率最高，由此可以得出黃酮對溫度的敏感程度高于內酯B對溫度的敏感程度。因此，提取溫度50℃為宜。

圖2　提取溫度對銀杏葉黃酮與內酯B得率的影響Fig.2　Effect of extraction temperature on yield of flavonoids and ginkgolide B fromGinkgo biloba

2.3乙醇體積分數對超聲協同微波萃取銀杏葉黃酮與內酯B得率的影響

圖3　乙醇體積分數對銀杏葉黃酮與內酯B得率的影響Fig.3　Effect of ethanol content on yield of flavonoids and ginkgolide B fromGinkgo biloba

由圖3可以看出，乙醇體積分數分別在40%～60%及40%～70%，隨著乙醇體積分數的增加，銀杏葉黃酮與內酯B得率逐漸增大；當乙醇體積分數分別為60%、70%時，銀杏葉黃酮、銀杏葉內酯B得率達到最大值；當乙醇體積分數分別高于60%、70%時，銀杏葉黃酮、銀杏葉內酯B得率逐漸降低。這與活性組分極性有關，由于銀杏葉內酯B由倍半萜內酯和二萜內酯組成，極性相比較黃酮來說較小，因此容易被高體積分數乙醇溶劑浸提，低體積分數乙醇會導致活性組分不能完全溶出。因此，考慮到兩種有效活性成分的提取，選60%為最佳的乙醇體積分數。

2.4提取時間對超聲協同微波萃取銀杏葉黃酮與內酯B得率的影響

由圖4可以看出，提取時間在1～4 min內，銀杏葉黃酮與內酯B的得率隨提取時間的延長而增大，這是因為隨著提取時間的增加，在超聲波微波協同作用下，溶劑分子運動加快，不斷促進銀杏葉活性成分的溶出；當提取時間為4 min，銀杏葉黃酮與內酯B的得率達到最大值；當提取時間＞4 min后，銀杏葉黃酮與內酯B的得率出現下降趨勢，一方面可能是因為乙醇溶劑的揮發造成浸提不充分，另一方面可能是超聲波微波協同長時間的作用有可能造成活性成分的損失或破壞。因此，提取時間4 min為宜。

圖4　提取時間對銀杏葉黃酮與內酯B得率的影響Fig.4　Effect of extraction time on yield of flavonoids and ginkgolide B fromGinkgo biloba

2.5提取條件優化正交試驗

以銀杏葉黃酮與內酯B綜合得率為考察指標進行正交試驗，結果與分析見表2，方差分析見表3。

表2　提取條件優化正交試驗結果與分析Table 2　Results and analysis of orthogonal experiments for extraction conditions optimization

表3　正交試驗結果方差分析Table 3　Variance analysis of orthogonal experiments results

由表2可以看出，各因素對銀杏葉黃酮和內酯B綜合得率的影響因素順序為：提取溫度＞料液比＞乙醇體積分數＞提取時間，提取條件的最佳組合為A1B2C3D2，即超聲-微波協同提取銀杏葉黃酮與內酯B的最優工藝條件為：料液比1∶20（g∶mL），提取溫度50℃，乙醇體積分數70%和提取時間4 min。在此最佳條件下進行3次驗證試驗，銀杏葉黃酮得率為2.25%，內酯B得率為0.81%。

由表3可知，對銀杏葉黃酮與內酯B綜合得率影響顯著的是料液比和乙醇體積分數（P＜0.05）。提取溫度對銀杏葉黃酮與內酯B的影響極顯著（P＜0.01）。

3　結論

超聲-微波協同萃取銀杏葉黃酮與內酯B的最佳工藝條件為：料液比1∶20（g∶mL），提取溫度50℃，乙醇體積分數70%，提取時間4 min。在此最佳條件下，銀杏葉黃酮得率為2.25%，內酯B得率為0.81%，綜合得率為1.39%。超聲-微波協同提取銀杏葉黃酮與內酯B兩種有效成分可以大大縮短提取時間，有效地提高了銀杏葉黃酮和內酯B的得率，優于傳統提取方法，是一種新型有效的提取方法，并為后續銀杏葉黃酮與內酯B的分離奠定了基礎。

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Extraction of flavonoids and ginkgolide B fromGinkgo bilobaby ultrasonic wave and microwave synergistic technology

WU Hao1,2,ZONG Zhimin2,LI Xiuxiu1
(1.School of Chemical Engineering,Xuzhou College of Industrial Technology,Xuzhou 221140,China; 2.School of Chemical Engineering＆Technology,China University of Mining and Technology,Xuzhou 221116,China)

The optimum extraction conditions of flavonoids and ginkgolide B fromGinkgo bilobawere researched by ultrasonic wave and microwave synergistic technology.Using the yield ofG.bilobaflavonoids and ginkgolide B as evaluation indexes,the effects of solid-liquid ratio,extraction temperature,ethanol content and extraction time on the yield ofG.bilobaflavonoids and ginkgolide B were discussed,and the extraction conditions were optimized by single factor and orthogonal experiments.The results showed that the optimum extraction conditions were solid-liquid ratio 1∶20 (g∶ml),extraction temperature 50℃,ethanol content 70%and extraction time 4 min.Under the optimum conditions,the yield ofG.bilobaflavonoids and ginkgolide B were 2.25%and 0.81%,respectively.

Ginkgo biloba;flavonoids;ginkgolide B;ultrasonic wave;microwave;extraction conditions

R282.71

0254-5071（2016）10-0153-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.10.034

2016-09-13

徐州市生化資源綜合利用與清潔生產重點實驗室課題和校級課題（20550886599950）

吳昊（1980-），男，副教授，博士研究生，研究方向為生物活性物質提取及資源綜合利用。