高效液相色譜法測定青稞紅曲中內酯式和酸式洛伐他汀的含量

陳發貴，張丹，劉敏，熊燕，張森林，趙輝*

（1.青藏高原微生物國家地方聯合工程中心，西藏拉薩850000；2.西藏月王生物技術有限公司，西藏拉薩850000）

高效液相色譜法測定青稞紅曲中內酯式和酸式洛伐他汀的含量

陳發貴1,2，張丹2，劉敏1,2，熊燕1,2，張森林2，趙輝2*

（1.青藏高原微生物國家地方聯合工程中心，西藏拉薩850000；2.西藏月王生物技術有限公司，西藏拉薩850000）

采用高效液相色譜法測定青稞紅曲中內酯和酸式洛伐他汀的含量，以體積分數75%的乙醇作為提取劑，在室溫條件下超聲提取青稞紅曲中的洛伐他汀1 h。使用Eclipse Plus C18柱（5 μm，250 mm×4.6 mm），調整柱溫30℃，流動相為甲醇∶0.1%磷酸=73∶27；流速1.0 mL/min；進樣量20 μL；紫外檢測器波長238 nm。內酯式洛伐他汀標準品溶液在20～100 μg/mL時呈良好的線性（r2=0.999 7），內酯式洛伐他汀的平均回收率為99.30%，相對標準偏差為1.67%；酸式洛伐他汀標準品溶液在20～100 μg/mL時呈良好的線性（r2=0.999 9），酸式洛伐他汀的平均回收率為98.50%，相對標準偏差為1.65%。因此高效液相色譜法能夠簡便、快捷、準確測定青稞紅曲中內酯式和酸式洛伐他汀的含量。

青稞紅曲；洛伐他汀；酸式洛伐他汀；高效液相色譜

青稞[1]是禾本科大麥屬的一種禾谷類作物，因其內外穎殼分離，籽粒裸露，故又稱裸大麥、元麥、米大麥。紅曲[2]別名赤曲、丹曲、紅米、福曲、紅大米、紅槽、紅曲米，以秈米為原料，接種優質的紅曲霉菌經深層發酵而成，是一種純天然、安全性高、有益于人體健康的食品添加劑和藥材[3]，其中含有的洛伐他汀具有優良的降脂功能[4]。青稞紅曲[5]是以禾本科植物青稞的果實為原料，接種紅曲菌，經固態發酵而成的功能性紅曲，具有藥食兼用的特性。青稞紅曲主要含有豐富的色素[6]、他汀類（主要為洛伐他汀）、γ-氨基丁酸和β-葡聚糖[7]等物質。

紅曲發酵產生的洛伐他汀有酸式和內酯式兩種形態[8-10]，其中酸式洛伐他汀為藥理活性形態，因其化學結構中開環羥基酸部分與3-羥基-3-甲基-戊二酰CoA（HMG-CoA）的化學結構十分類似，可用于膽固醇合成的早期階段，競爭性地抑制膽固醇生物合成限速酶——HMG-CoA還原酶。因此，在評價紅曲洛伐他汀含量時不能單獨測定內酯的含量或者將內酯轉化為酸式進行測定，應當同時測定內酯式和酸式洛伐他汀的含量，這樣才能真實反映紅曲中洛伐他汀的含量[11-15]，對紅曲的品質做出全面的評價。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

甲醇（色譜純）：成都市科隆化學品有限公司；磷酸、乙醇（均為分析純）：成都市科龍化工試劑廠；洛伐他汀標準品（C24H36O5，99.4%，批號100600-201003）中國食品藥品檢定研究院；實驗用水為超純水；青稞紅曲藥材：西藏月王藏藥有限責任公司。

1.2儀器與設備

安捷倫1260 infinity高效液相色譜（high performanceliquid chromatography，HPLC）儀，可變波長VWD檢測器：安捷倫科技有限公司；BSA224S電子天平：賽多利斯科學儀器有限公司；SB-5200D超聲波清洗機：寧波新芝生物科技有限公司。

1.3方法

1.3.1標準溶液制備

內酯洛伐他汀標準溶液制備：準確稱取洛伐他汀標準品20.00 mg，用體積分數75%乙醇定容至100 mL，即得質量濃度為0.2 mg/mL的洛伐他汀標準貯備液。

酸式洛伐他汀標準溶液制備：準確稱取洛伐他汀標準品20.00 mg，用0.2 mol/L氫氧化鈉溶液定容至100 mL，在50℃條件下超聲轉化1 h，自然冷卻至室溫后靜置1 h，即得質量濃度為0.2 mg/mL的酸式洛伐他汀標準貯備液[16]。

1.3.2樣品溶液制備

取適量青稞紅曲，粉碎，過40目篩，取篩下粉末混合均勻。準確稱取約0.5 g，試樣置于50 mL容量瓶中。加入30 mL體積分數75%的乙醇，搖勻，室溫條件下超聲提取（功率240 W，40 kHz）50 min。加體積分數75%的乙醇接近刻度，再超聲10 min，冷卻至室溫，用體積分數75%的乙醇定容至50mL。搖勻后4 000 r/min離心10 min，取上清液過0.24 μm微孔濾膜，收集濾液用于高效液相色譜測定。

1.3.3色譜條件

色譜柱：Eclipse Plus C18柱（250 mm×4.6 mm）；柱溫：30℃；流動相：甲醇∶0.1%磷酸=73∶27；流速：1.0 mL/min；進樣量：20 μL；紫外檢測器波長：238 nm。

1.3.4方法學驗證

（1）標準曲線

準確量取1.3.1中的內酯洛伐他汀標準貯備液1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL分別于10 mL容量瓶中，用體積分數75%的乙醇稀釋至刻度，制成20 μg/mL、40 μg/mL、60 μg/mL、80 μg/mL、100 μg/mL的內酯洛伐他汀溶液；準確量取1.3.1中的酸式洛伐他汀標準貯備液1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL分別于10 mL容量瓶中，用體積分數75%乙醇稀釋至刻度，制成20 μg/mL、40 μg/mL、60 μg/mL、80 μg/mL、100 μg/mL的酸式洛伐他汀溶液。兩種溶液分別經過0.24 μm微孔濾膜過濾，取濾液，進HPLC測定。記錄色譜圖，以質量濃度為X軸、峰面積為Y軸，繪制標準曲線。

（2）精密度實驗

分別準確吸取質量濃度為20 μg/mL的內酯洛伐他汀溶液和酸式洛伐他汀溶液，各重復進樣6次（進樣量20 μL）測定，記錄色譜圖，計算相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）。

（3）重復性實驗

取適量粉碎后的同一批次青稞紅曲藥材，準確稱取6份，每份約0.5 g。按照1.3.2中樣品溶液制備方法進行處理并測定，記錄色譜圖，分別計算樣品中內酯洛伐他汀和酸式洛伐他汀含量及RSD。

（4）穩定性實驗

取按照1.3.2中樣品制備方法制備的供試品溶液，分別于0、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h進樣測定，記錄色譜圖，計算RSD。

1.3.5加標回收率實驗

內酯洛伐他汀加標回收率實驗：取適量已知含量的青稞紅曲藥材粉末，準確稱取9份，每份約0.5 g，分別置于50 mL容量瓶中，分別加入6 mL、8 mL、10 mL按1.3.1方法配制的內酯洛伐他汀標準貯備液各3份，其余按照1.3.2處理并測定，記錄色譜圖，計算平均回收率。

酸式洛伐他汀加標回收率實驗：取適量已知含量的青稞紅曲藥材粉末，準確稱取9份，每份約0.5 g，分別置于50 mL容量瓶中，分別加入6.5 mL、9.0 mL、11.5 mL按1.3.1方法配制的酸式洛伐他汀標準貯備液各3份，其余按照1.3.2處理并測定，記錄色譜圖，計算平均回收率。

2　結果與分析

2.1標準曲線

內酯式洛伐他汀標準曲線見圖1。

回收率=

圖1　內酯式洛伐他汀標準曲線Fig.1　Standard curve of lovastatin

由圖1可知，內酯式洛伐他汀標準品溶液在20～100 μg/mL時呈良好的線性，標準曲線方程為y=76.872x-5.948（R2=0.999 7）。

酸式洛伐他汀標準曲線見圖2。

由圖2可知，酸式洛伐他汀標準品溶液在20～100 μg/mL時呈良好的線性，標準曲線方程為y=73.766x-53.678（R2=0.999）。

2.2精密度實驗

方法的精密度實驗結果見表1。

由表1可知，內酯洛伐他汀的對照品重復進樣6次，峰面積RSD為0.52%，酸式洛伐他汀的對照品重復進樣6次，峰面積RSD為0.56%，結果表明，系統精密度良好。

2.3重復性實驗

方法的重復性實驗結果見表2。

表2　方法的重復性實驗結果Table 2　Repeatability results of the method

由表2可知，內酯洛伐他汀平均含量為2.31 mg/g，RSD為1.33%；酸式洛伐他汀平均含量為3.02 mg/g，RSD為1.67%。表明方法重復性良好。

2.4穩定性實驗

方法的穩定性實驗結果見表3。

表3　方法的穩定性實驗結果Table 3　Stability results of the method

由表3可知，內酯洛伐他汀峰面積的RSD為1.15%，酸式洛伐他汀峰面積的RSD為1.41%。在本實驗條件下，供試品溶液在12 h內穩定。

2.5加標回收率實驗

內酯洛伐他汀加標回收率實驗結果見表4。

表4　洛伐他汀內酯加標回收率實驗結果Table 4　Adding standard recovery results of lovastatin

由表4可知，內酯洛伐他汀的平均加標回收率為99.31%，RSD為1.65%。樣品加標回收率在97.08%～102.27%，表明該方法準確度良好。

酸式洛伐他汀加標回收率實驗結果見表5。

表5　酸式洛伐他汀加標回收率實驗結果Table 5　Adding standard recovery results of lovastatin acid

由表5可知，酸式洛伐他汀的平均加標回收率為99.04%，RSD為1.63%。樣品加標回收率在97.52%～102.64%，表明該方法準確度良好。

2.6實際樣品測定結果

實際樣品測定結果見表6，內酯、酸式洛伐他汀標準品色譜圖及樣品色譜圖見圖3。

表6　實際樣品測定結果Table 6　Determination results of samples

由圖3可知，樣品中2種洛伐他汀出峰時間和2種洛伐他汀標準品出峰時間相近，分離度良好，并且附近不存在干擾峰，表明檢測結果準確。

3　結論

本文所建立的高效液相色譜法測定青稞紅曲藥材中內酯和酸式洛伐他汀的方法簡便、快捷、結果準確，所選用的流動相毒性較低，此方法可以在青稞紅曲藥材片生產過程中用于洛伐他汀含量的檢測和飲片質量控制。

圖3　內酯式洛伐他汀標準品(A)、酸式洛伐他汀標準品(B)以及樣品(C)高效液相色譜圖Fig.3　HPLC chromatography of lovastatin standard(A), lovastatin acid standard(B)and sample(C)

[1]臧靖巍，闞建全，陳宗道，等.青稞的成分研究及其應用現狀[J].中國食品添加劑，2004（4）：43-46

[2]周立平.紅曲霉在中國的生產及其應用（上）[J].中國釀造，2004，23（9）：1-4.

[3]周立平.紅曲霉在中國的生產及其應用（下）[J].中國釀造，2004，23（10）：5-7.

[4]趙秀舉，劉志國.紅曲洛伐他汀發酵條件優化及降脂功能[J].中國釀造，2014，33（1）：32-35.

[5]周禮紅，萬強，劉敏，等.青稞紅曲固態發酵工藝研究初探[J].中國釀造，2012，31（10）：46-49.

[6]陳發貴，劉敏，熊燕，等.青稞紅曲色素穩定性影響因素的分析[J].食品科技，2016，41（2）：300-303.

[7]譚友莉.青稞紅曲化學成分與質量標準的初步研究[D].成都：成都中醫藥大學，2015.

[8]姜冰潔，許贛榮，張薄博，等.降脂紅曲產品質量標準的探討[J].中草藥，2015，46（3）：453-456.

[9]魏巍.紅曲霉發酵合成洛伐他汀的研究[D].武漢：華中科技大學，2013.

[10]張秋燕，王家龍，白鴿.紅曲藥材中活性成分洛伐他汀和毒性成分桔霉素的HPLC-DAD/FLD測定[J].時珍國醫國藥，2016，27（4）：816-819.

[11]張小茜，周富榮，石濟民.高效液相色譜法測血脂康膠囊及紅曲中洛伐他汀的含量[J].中國中藥雜志，1997，22（4）：222-224.

[12]朱華，許贛榮，陳蘊.HPLC法測定紅曲中酸型與內酯型Monacolin K[J].無錫輕工大學學報，2003，22（3）：46-52.

[13]范雯.高效液相色譜法測定紅曲藥材中洛伐他汀的含量[J].現代醫藥衛生，2013，29（16）：2417-2419.

[14]張艷紅，侯團章，張勝.高效液相色譜法測定紅曲米中洛伐他汀的含量[J].食品科學，2001，22（7）：67-69.

[15]杜方鳴，于燕梅，李洲，等.高效液相色譜法分離測定洛伐他汀及其開環酸[J].分析測試技術與儀器，2003，9（2）：95-97.

[16]中華人民共和國國家發展和改革委員會.QB/T 2847—2007功能性紅曲米（粉）[S].北京：中國標準出版社，2007.

Content determination of lovastatin and lovastatin acid in highland barleyMonascusby HPLC

CHEN Fagui1,2,ZHANG Dan2,LIU Min1,2,XIONG Yan1,2,ZHANG Senlin2,ZHAO Hui2*
(1.National United Engineering Research Center for Tibet Plateau Microbiology,Lhasa 850000,China; 2.Tibet Yuewang Biologic Technetronic Co.,Ltd.,Lhasa 850000,China)

Lovastatin and lovastatin acid in the highland barleyMonascuswere determined by HPLC.The sample was extracted using 75%ethanol as extraction solvent at room temperature for 1 h,then detected by HPLC method with Eclipse Plus C18column(5 μm,250 mm×4.6 mm)at column temperature 30℃,methanol-0.1%phosphate solution(73∶27)as mobile phase,flow rate 1.0 ml/min,sample quantity 20 μl and detection wavelength 238 nm.The linear range of lovastatin was 20-100 μg/ml(r2=0.9997),the mean recovery was 99.30%,and the relative standard deviation was 1.67%. While the linear range of lovastatin acid was 20-100 μg/ml(r2=0.999 9),the mean recovery was 98.50%,and the relative standard deviation was 1.65%.The HPLC method to determine the content of lovastatin and lovastatin acid in the highland barleyMonascuswas convenient,rapid and accurate.

highland barleyMonascus;lovastatin;lovastatin acid;HPLC

O657.7

0254-5071（2016）10-0162-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.10.036

2016-07-16

陳發貴（1988-），男，本科，研究方向為微生物生物發酵工程。

趙輝（1969-），男，高級工程師，碩士，研究方向為發酵工程、工商行政管理。