中國水仙類黃酮-3-O-葡糖基轉移酶基因的原核表達

王偉英，李海明，戴藝民，李躍森，鄒 暉，吳水金，林江波

(福建省農業科學院亞熱帶農業研究所，福建 漳州 363005)

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中國水仙類黃酮-3-O-葡糖基轉移酶基因的原核表達

王偉英，李海明，戴藝民，李躍森，鄒 暉，吳水金，林江波﹡

(福建省農業科學院亞熱帶農業研究所，福建 漳州 363005)

通過雙酶切、連接轉化等方法將中國水仙類黃酮-3-O-葡糖基轉移酶(NT3GT)基因克隆到原核表達載體pET29a上，構建原核表達重組質粒pET29a-NT3GT。重組質粒轉化至E.coliBL21(DE3)后經IPTG誘導，SDS-PAGE分析表明，經IPTG誘導，NT3GT基因在大腸桿菌BL21(DE3)中獲得了高效表達，表達的融合蛋白分子量約為55 kDa。成功構建其原核表達載體并使其在大腸桿菌中得到高效表達，為NT3GT抗血清的制備及功能分析奠定基礎。

中國水仙；類黃酮-3-氧-葡糖基轉移酶；原核表達

中國水仙Narcissustazetta.var.Chinensis隸屬石蒜科水仙屬Amaryllidaceae，多年生草本植物，是多花水仙的一個變種。類黃酮 -3-O- 葡萄糖基轉移酶(3GT) 是花青苷(Anthocyanins) 生物合成途徑中的關鍵酶,它主要負責將不穩定的花色素轉變為穩定的花色素苷,催化無色的花色素生成有色的花色苷, 對花色起著調控作用[1-3]。目前已經對多種植物的3GT已有深入的研究[4-7]，通過基因工程來改變花色是觀賞植物的花色改良和培育新品種的重要方法。但曾黎輝[8]等認為缺乏花青素可能是中國水仙花色單一的主要原因，推測中國水仙花瓣和副冠中也缺少ANS基因的表達，沒有ANS基因的表達可能是中國水仙不能合成花青素的主要原因。對于這個推測還需要更多的研究來進一步驗證，以期早日培育水仙新品種。

本作者在已發表的“中國水仙類黃酮-3-O-葡糖基轉移酶基因的克隆與表達分析”[4]的研究中從中國水仙上分離克隆得到Nt3GT基因，其cDNA全長1 682 bp，包含有1個1 461 bp完整閱讀框架(ORF)，編碼487個氨基酸，具有Glycos_tranf_1superfamily 蛋白保守區。要了解Nt3GT在植物體內的酶學特性和生物學功能，必須要在蛋白水平進行研究。原核表達系統具有產量高、易操作、穩定性好、經濟實惠等優點[9-11]，為研究Nt3GT蛋白的表達和功能提供了一條有效的途徑。本研究是利用pET29a為載體，探索NT3GT在大腸桿菌BL21中的表達，為進一步研究NT3GT蛋白結構和功能的關系提供了試驗基礎，也為下一步利用花色基因進行遺傳轉化奠定基礎，以期為中國水仙花色遺傳改良提供一條新途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

1.1.1 試驗材料 前期在“中國水仙類黃酮-3-O-葡糖基轉移酶基因的克隆與表達分析”[4]的實驗中已儲存本試驗所需試驗材料。

1.1.2 主要試劑 大腸桿菌(Esherichia coli)的菌株HB101和BL21(DE3)由福建省農業科學院亞熱帶農業研究所實驗室保存。原核表達載體 pET-29a購自寶生物工程(大連)有限公司。

ExTaqDNA聚合酶、PrimeScriptTM Reverse Transcriptase、RNAiso Plus和DNA膠回收試劑盒及質粒提取回收試劑盒購自上海生工生物工程技術服務有限公司，引物和測序由上海生工生物工程技術服務有限公司完成。

1.2 PCR引物的設計與合成

根據已克隆出的Nt3GT的OFR序列[4]，設計含有KpnⅠ和SalⅠ酶切位點的特異擴增引物，為GT1:5′-GGG GGT ACC ATG ACC AGC AAA AAT GAC-3′(下劃線為KpnⅠ酶切位點)，GT2:5′-GGG GTC GAC GAT ATC ATA CTG CAG TCT TC-3′( 下劃線為SalⅠ酶切位點)。

1.3 原核表達載體的構建

以Nt3GT全長cDNA為模板，3GT1和3GT2為引物，PCR擴增Nt3GTOFR序列。PCR擴增條件如下：94℃預變性5min，94℃變性30 s，60℃退火45 s，72℃延伸1 min，30個循環，最后72℃延伸10 min。

將含有KpnⅠ和SalⅠ酶切位點的Nt3GTOFR和pET29a原核表達載體同時用KpnⅠ和SalⅠ進行雙酶切，回收目的基因片段和原核表達載體大片段，并將回收好的大小片段按一定體系用T4-DNA連接酶16℃連接過夜，并將連接產物轉化大腸桿菌HB101感受態細胞，涂布于100 mg·L-1氨芐抗性固體LB培養基37℃恒溫箱中培養12 h，挑取單克隆進行PCR和雙酶切鑒定。

1.4 重組蛋白的誘導表達及SDS-PAGE檢測

將構建成功的重組質粒pET29a-Nt3GT轉化大腸桿菌BL21感受態細胞，經PCR鑒定后挑取陽性單克隆菌落接種于3 mL含100 mg·L-1卡那霉素的LB液體培養基中37℃培養過夜。各取上述過夜菌100 μL轉入3 mL含100 mg·L-1卡那霉素的LB液體培養基中37℃培養至OD600=0.6左右時，取出1 mL菌液作為誘導前的電泳樣品(作為對照)，剩余培養液加入IPTG至終濃度為1 mmol·L-1，繼續誘導培養3 h，獲得誘導菌液。

重組蛋白的SDS-PAGE檢測：取1mL經誘導的菌液，連同誘導前樣品，13 000 r·min-1離心1 min收集菌體，加入Tris-HCl緩沖液懸浮菌體用槍頭吹打菌體使菌體重懸，在冰浴中超聲波破碎細胞，破碎10 s，間隔10 s，共破碎5 min；收集混合液后4℃，12 000 r·min-1離心15 min，上清和沉淀樣品中分別加入凝膠上樣緩沖液，100℃水浴變性處理10 min。吸取30 μL加樣于14%SDS-PAGE電泳，凝膠用考馬斯亮藍染色。

2 結果與分析

2.1 目的基因片段的獲得

以Nt3GT全長cDNA為模板，3GT1和3GT2為引物，PCR擴增Nt3GTOFR序列，擴增產物在1 461 bp出現特異性條帶，大小與預期相符。將擴增出來的目的片段用2個酶同時進行雙酶切(圖1)，回收測序鑒定正確，可用于表達載體的構建。

2.2 原核表達載體的構建與鑒定

將pET29a原核表達載體用KpnⅠ和SalⅠ進行雙酶切，回收原核表達載體大片段，與2.1中獲得的目的基因的酶切片段連接并轉化大腸桿菌HB101感受態細胞，轉化成功的菌株挑取單克隆做菌落PCR鑒定(圖2-A)，PCR鑒定為陽性的菌落搖菌提取質粒進一步做雙酶切鑒定(圖2-B)，酶切產物與PCR產物大小一致。將目的條帶測序，序列比對結果正確，表明pET29a-Nt3GT原核表達載體構建成功。

2.3 重組蛋白的誘導表達

將構建好的pET29a-Nt3GT重組子轉入表達菌株BL21中，挑取的3個菌斑經PCR檢測均為陽性克隆(圖3)，表明pET29a-Nt3GT重組子成功轉入表達菌株中。進行擴大培養，利用IPTG誘導菌體表達，提取蛋白質進行SDS-PAGE電泳分析(圖4)，目的蛋白主要在沉淀中，在大小約55 kDa處出現一較高濃度的誘導表達條帶，與預計的重組Nt3GT蛋白大小一致，而未經過IPTG誘導表達的樣品在約55 kDa處出現1條很淡的條帶，為重組Nt3GT蛋白的基礎表達；上清中看不到表達條帶，說明表達產物主要以包涵體形式存在，這可能與目的蛋白表達量很高及原核表達通常存在目的蛋白以包涵體的形式表達有關。

3 討論與結論

pET是目前應用最為廣泛的原核表達系統，已經成功地在大腸桿菌中表達了各種各樣的外源蛋白。外源基因能否在大腸桿菌中正確表達，受到很多因子的影響，如目的基因本身的特性(稀有密碼子的多少，是否是跨膜蛋白等)、誘導溫度和時間等[10]。本試驗中選用的BL21是常用的原核表達菌株，BL21細胞基因組中的T7啟動子能夠被 IPTG誘導，誘導后能夠增加其下游基因產物T7 RNA 聚合酶的表達，T7 RNA 聚合酶又能夠使轉入BL21細胞中的質粒目的基因轉錄成mRNA，進而表達為蛋白質[12]，而IPTG誘導可以使BL21細胞表達更多目的蛋白質，但獲得的蛋白通常以包涵體的形式表達。包涵體蛋白雖然往往無生物活性，需要重新溶解和復性，但包涵體的形成有利于防止蛋白酶對表達蛋白的降解，增加了產物的穩定性，同時包涵體中雜蛋白的含量少，這也為重組蛋白的分離與純化帶來了極大的方便，通過對包涵體的純化，可得到純度較高的目的蛋白[13-14]。本研究構建表達載體pET29a-Nt3GT，在 37℃、3 h 誘導條件下在BL21 大腸桿菌中正確表達，并有很高的表達量，以形成包涵體為主。這為后續試驗如NT3GT蛋白的純化、多克隆抗體的制備以及酶活分析等奠定了基礎。

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(責任編輯：黃愛萍)

Prokaryotic Expression of 3 GT Gene fromNarcissustazettavar. Chinensis

WANG Wei-Ying,LI Hai-Ming,DAI Yi-Min,ZOU Hui,WU Shui-Jin,LI Yue-Sen,LIN Jiang-Bo*

(SubtropicalAgricultureResearchInstitute,FujianAcademyofAgriculturalSciences,Zhangzhou,Fujian363005,China)

Flavonoid 3-O-glucosyltransferase(Nt3GT) gene ofNarcissustazettavar. Chinensis was cloned into the vector,pET29a, to construct prokaryotic expression recombinant plasmid, pET29a-NT3GT.The recombinant plasmid was transferred toE.coliBL21(DE3) to be induced by IPTG. Subsequently, the expression of the target protein was verified by SDS-PAGE. Then, pET29a-Nt3GT was successfully constructed,which induced the 55 kDa recombinant protein of Nt3GT in the prokaryotic expression system. Nt3GT was cloned, and its vector was constructed and induced to be expressed successfully by IPTG in BL21 providing a basis for theantiserum preparation and functional analysis in the future.

Narcissustazettavar. Chinensis; 3GT; prokaryotic expression

2016-05-16初稿；2016-05-30修改稿

王偉英(1980- )，女，碩士，助理研究員，主要從事植物逆境生理和分子生物學研究(E-mail: weiyingwang178@126.com)

*通訊作者：林江波(1976-)男，碩士，副研究員，主要從事分子生物學研究(E-mail: linjiangbo1976@yahoo.com.cn)

福建省自然科學基金項目(2014J01098)

Q 522

A

1008-0384(2016)08-816-04

王偉英，李海明，戴藝民，等.中國水仙類黃酮-3-O-葡糖基轉移酶基因的原核表達[J].福建農業學報，2016，31(8)：816-819.

WANG W-Y，LI H-M，DAI Y-M，et al.Prokaryotic Expression of 3 GT Gene fromNarcissustazettavar. Chinensis[J].FujianJournalofAgriculturalSciences，2016，31(8)：816-819.