水稻抗稻瘟病基因分子檢測及抗性評價

周 鵬，涂詩航，董瑞霞，王洪飛，鄭 軼，王志賦，張水金，游晴如，董練飛，黃庭旭，鄭家團

(福建省農業科學院水稻研究所，福建 福州 350018)

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水稻抗稻瘟病基因分子檢測及抗性評價

周 鵬，涂詩航，董瑞霞，王洪飛，鄭 軼，王志賦，張水金，游晴如，董練飛，黃庭旭，鄭家團*

(福建省農業科學院水稻研究所，福建 福州 350018)

為預防單一稻瘟病基因抗性容易喪失，培育持久性抗稻瘟病水稻新品種，本研究利用4份保持系、6份恢復系和3份常規稻品種為受體親本，以75-1-127(含有稻瘟病基因Pi9)和U19(含有抗稻瘟病基因Pi25)為供體親本，經過多代選擇，獲得了48份田間高代材料。葉瘟抗性鑒定結果表明，48份高代株系材料中5份表現抗，25份表現為中抗，其余均表現為中感及以上。分子標記輔助選擇結果表明，19份高代株系含有抗稻瘟病基因Pi9，5份含有抗稻瘟病基因Pi25。

水稻；葉瘟；抗性；分子標記

水稻是全球一半以上人口賴以生存的基本食糧，而中國是世界第一水稻生產國和消費國。21世紀以來，中國水稻種植面積無增長，單產提高慢，總產量增長少，近15年來僅增長7.1%。目前，影響水稻生產的病害主要有3種，稻瘟病是其中之一，每年可造成10%～30%的損失，同時對稻米品質也造成不良影響，對我國糧食安全生產造成了巨大的危害[1]。因此選育抗稻瘟病的雜交水稻新品種長期以來是育種家的主要目標之一。某一品種或抗病基因的大面積單一化應用會導致病稻瘟病菌某一特定優勢小種群的形成和發展，最終導致稻瘟病的大面積暴發和流行[2]。福建省是稻瘟病發病較嚴重的地區，近年來，在參加福建省或全國南方水稻區試的品種中，抗性品種的比例很低，抗性差嚴重地影響了雜交稻組合的推廣應用。鑒于稻瘟病的危害性，目前，福建省水稻品種審定對新育成品種的抗稻瘟病性實行一票否決，很多高產、優質雜交稻新品種因抗瘟性不達標而不能通過品種審定[3]。

水稻抗稻瘟病基因Pi9來源于小粒野生稻，位于水稻6號染色體上[4]，對來自13個國家43個稻瘟病小種表現出很高的抗性[5]，是目前利用分子標記輔助選擇技術改良稻瘟病抗性使用最廣泛的主效抗性基因之一。源自秈稻品種“谷梅2號”的抗稻瘟病主效基因Pi25[6]，位于水稻6號染色體上，對中國稻瘟病菌系92-183有較強的葉瘟和穗頸瘟抗性，近年來相繼報道了采用分子標記技術將Pi25基因轉育到栽培稻中[7-10]。

本研究同時以含有抗稻瘟病基因Pi9的水稻材料75-1-127和含有抗稻瘟病基因Pi25的中間材料U19為抗源選育雜交水稻恢復系和保持系，獲得了48份水稻高代新株系，通過在福建省上杭縣茶地鄉稻瘟病重發區進行稻瘟病自然誘發鑒定，評價其稻瘟病抗性水平，同時通過分子標記檢測探明其抗性基因來源，為以后配制抗病雜交水稻新品種及抗病新材料的創制奠定基礎，也預防了單一抗性基因的抗性易喪失的風險。

1 材料與方法

1.1 供試材料

以三系雜交水稻的4份保持系福稻B、福農B、14B和元豐B，6份恢復系X5、X9、蜀恢527、明恢86、閩恢3301和內恢9802，以及3份常規稻華航絲苗、繁9和勝巴絲苗為受體親本，以抗瘟材料75-1-127(含有稻瘟病抗性基因Pi9)和U19(由中國水稻研究所莊杰云提供，含有稻瘟病抗性基因Pi25)為抗源育成的48份水稻新品系為抗性鑒定材料；以2個供體親本為抗性對照，以廣陸矮4號為感病對照。

1.2 葉瘟田間自然誘發鑒定

2014-2015年，田間葉瘟自然誘發鑒定圃設在福建省上杭縣茶地鑒定圃進行。每個品種播種1條，3個重復，5月26日播種，每條播種100粒，四周設誘發行，以廣陸矮4號為誘發品種。不噴施農藥，施氮肥，施用量高于普通大田20%。

1.3 葉瘟的調查方法

出苗后30 d人工噴施菌液使充分發病。葉瘟的調查在開始出現病斑后10 ～15 d進行，按0～9級標準調查病情，調查方法參照鄭軼等[11]的方法。在供試材料的2 a抗性水平中，以級數最高的為該材料的稻瘟病綜合抗性水平。

1.4 水稻基因組DNA的提取

采取出苗后20 d的鮮嫩葉片5 g，采用孫川等[12]的方法制備水稻基因組DNA。

1.5 抗病基因PCR檢測

抗性基因Pi9的檢測選用分子標記pB8，抗性基因Pi25的檢測選用連鎖STS標記Si13070D，由上海生物工程技術公司合成。抗性基因Pi9的檢測參照張薈等[13]的方法。抗性基因Pi25的檢測PCR反應體系為10 μL，其中2×TaqPCR Master Mix混合酶5 μL，模板DNA 1 μL，10 μmol·L-1的引物各0.5 μL，加ddH20補足10 μL。PCR反應程序為94℃預變性5 min，94℃變性30 s，55℃復性30 s，72℃延伸30 s，35個循環，72℃延伸7 min，4℃保存，產物通過6%聚丙烯酰胺凝膠電泳，每孔點樣1.6 μL，用GetRed核酸染料染色，用BIO-RAD Imaging System成像系統成像分析。

2 結果與分析

2.1 48份水稻新品系葉瘟抗性水平

對48份水稻新品系在田間自然誘發鑒定圃的葉瘟抗性鑒定結果表1，其中5份水稻新品系葉瘟抗性表現為2級，占10.42%；14份抗性表現為3級，占29.17%；11份抗性表現為4級，占22.92%；7份抗性表現為5級，占15.58%；5份抗性表現為6級，占10.42%；5份抗性表現為7級，占10.42%；1份抗性表現為9級，占2.08%。圖1顯示了部分材料和抗感對照田間發病情況，抗感株系在病區的抗感界限分明。

表1 48份水稻新品系葉瘟抗性水平

2.2 不同抗源來源的水稻新品系的抗性比較

2個不同抗源育成的后代株系的抗性比較結果見表2。以75-1-127為抗源育成了30個株系，其中抗性達到抗水平的3個，中抗水平的株系17個，中感及以上水平的株系10個，達到中抗以上水平的株系約占66.67%；以U19為抗源育成了10個株系，其中抗性達到中抗水平的6個，中感及以上水平的株系5個，達到中抗以上水平的株系約占54.55%；以雙抗源育成了7個株系，其中抗性達到抗水平的4個，中感水平的株系3個，達到中抗以上水平的株系約占57.14%。

表2 不同抗源來源的水稻新品系抗性比較

Table 2 Blast-resistance of new rice lines derived from different resistance donors

抗源不同抗性水平新品系數量/個抗(R)中抗(MR)中感(MS)感(S)高感(HS)合計/個中抗以上新品系所占比例/%75?1?127317271306667U1906230115455雙抗源4030075714

2.3 48份新品系的抗性基因的檢測分析

利用與Pi9基因緊密連鎖的分子標記pB8對37份以75-1-127為抗源選育的高代株系材料進行分子檢測，獲得19份含有抗性基因Pi9的株系(圖2)，其中保持系12份，恢復系7份。19份株系材料的田間編號是BC177、BC203、BC309、BC311、BC617、BC901、EB511、EB557、EB558、EB559、EB560、EB561、EDF66、EDF69、EDF75、EDF77、EDF78、EDF79、EDF82。

利用與Pi25基因緊密連鎖的分子標記Si13070D進行親本間的多態性分析，結果表明，抗性對照谷梅2號、抗源U19能擴增出相同大小的單一條帶，與其他親本材料的擴增條帶存在多態性(圖3)，結果清晰，因此可以選擇Si13070D標記對高代材料進行分子標記檢測。對18份以U19為抗源選育的高代株系材料進行分子檢測，獲得5份含有抗性基因Pi25的株系(圖4)，其中保持系材料3份，恢復系材料2份。5份株系的田間編號分別是BC153、BC623、BC801、EDF80、EDF81。

3 討論與結論

稻瘟病是世界性水稻最具毀滅性的病害之一。實踐證明，選育和種植抗病品種是控制該病害最經濟有效的方法[14]。福建省是稻瘟病發生流行較嚴重的稻區之一，從1983年開展稻瘟病育種為中心的科技公關以來，育成了一大批水稻材料[15]。近10年以來，福建省共審定雜交水稻新品種168個，其中中抗以上品種24個，米質達部頒三級及以上的品種5個(數據來源于國家水稻數據中心。http://www.ricedata.cn/variety/)。育種材料各世代的抗病性鑒定是抗性育種的重要環節，研究表明[16-17]，對大量品系采用病圃自然發病的方法，可從大量材料中篩選出抗源材料供育種使用。隨著育種技術綜合應用的發展和育種水平的提高，超高產、強抗性雜交稻新品種的出世將為期不遠。本課題組近幾年通過重病區抗性自然誘發鑒定、分子標記輔助選擇技術篩選了近2萬份水稻育種材料及親本，獲得了一大批抗性優異的材料，大大提高了育種效率，取得了良好的效果。相關分析結果表明[11,18]，頸瘟鑒定的平均級與葉瘟的最高級和平均級呈極顯著正相關，表明葉瘟與頸瘟相關非常密切，在苗期鑒定葉瘟發病重的組合，頸瘟發病也重。因此，為了減少工作量，本研究選擇在苗期對高代材料進行稻瘟病抗性鑒定，淘汰感病株系，重點選育抗病株系，達到事半功倍的效果。在本研究中，葉瘟抗性鑒定及分子標記檢測結果不相一致，含有Pi9抗性基因的BC311株系卻表現為感稻瘟病，其可能與遺傳背景及抗病基因的純合程度相關；表現為中抗的BC127、BC325、ERK42、ER537、ER538、ER558卻未檢測出抗稻瘟病基因，其可能遺傳了福農B、華航絲苗的抗稻瘟病基因。探秘福農B含有的稻瘟病基因是本課題組的下一步目標。在以后的育種實踐中，應該堅持廣泛收集鑒定抗病資源，豐富品種的抗性遺傳背景，并長期跟蹤抗性材料的抗性變化趨勢，通過抗源多元化來增加品種的抗病年限。

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(責任編輯：林海清)

Molecular Detection and Resistance Determination of Rice Blast-resistance Genes

ZHOU Peng,TU Shi-hang,DONG Rui-xia,WANG Hong-fei,ZHENG Yi,WANG Zhi-fu,ZHANG Shui-jin,YOU Qing-ru,DONG Lian-fei,HUANG Ting-xu,ZHENG Jia-tuan*

(InstituteofRice,FujianAcademyofAgriculturalSciences,Fuzhou,Fujian350018,China)

To avoid a possible loss of blast-resistance in rice when a single resistance gene was dependent upon for the disease prevention, new rice varieties with durable rice blast-resistance were cultivated. Forty-eight field materials of advanced-generation were obtained through a multiple-generation selection from the crosses using 4 maintainer lines, 6 restorer lines and 3 conventional rice varieties as receptor parents with 75-1-127 (harboring blast genePi9) and U19 (harboring blast resistance genePi25) as donor parents. Evaluated by their resistance to the leaf blast disease, 5 lines were classified as highly resistant, 25 moderately resistant, and the remainders moderately or highly susceptible varieties. A marker-assisted selection showed that, among them, 19 advanced-generation lines carried blast-resistance genePi9, and 5 had blast-resistance genePi25.

rice; leaf blast; blast-resistance; molecular marker

2016-03-11初稿；2016-05-18修改稿

周鵬(1988-)，男，碩士研究生，助理研究員，研究方向：水稻遺傳育種

*通訊作者：鄭家團(1958-)，男，研究員，研究方向：水稻遺傳育種(E-mail:superrice63@163.com)

福建省科技計劃項目——省屬公益類科研院所基本科研專項(2015R1021-2)；國家863計劃項目(2011AA10A101)；福建省財政專項——福建省農業科學院科技創新團隊建設項目(CXTD-2-1312)；福建省現代農業水稻產業技術體系項目(閩財指[2014]1032)；福建省農業科學院青年人才創新基金(2011QB-13)

Q 343

A

1008-0384(2016)09-962-04

周鵬，涂詩航，董瑞霞，等.水稻抗稻瘟病基因分子檢測及抗性評價[J].福建農業學報，2016，31(9)：962-965.

ZHOU P，TU S-H，DONG R-X，et al.Molecular Detection and Resistance Determination of Rice Blast-resistance Genes[J].FujianJournalofAgriculturalSciences，2016，31(9)：962-965.