人cyclin B1對神經膠質瘤細胞增殖、侵襲和轉移的影響

高海濱，周劍云，王利清，王宇，孫煒

(中國康復研究中心北京博愛醫院 首都醫科大學康復醫學院，北京100068)

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人cyclin B1對神經膠質瘤細胞增殖、侵襲和轉移的影響

高海濱，周劍云，王利清，王宇，孫煒

(中國康復研究中心北京博愛醫院 首都醫科大學康復醫學院，北京100068)

目的 探討人細胞周期素B1(cyclin B1)對神經膠質瘤細胞增殖、侵襲和轉移的影響。方法 將體外培養的神經膠質瘤細胞U87MG隨機分為high cyclin B1組、control cyclin B1組、cyclin B1 siRNA組、control siRNA組，high cyclin B1組、control cyclin B1組瞬時轉染pcDNA3.1 cyclin B1及空載體，cyclin B1 siRNA組、control siRNA組瞬時轉染pGCsi-U6/Neo/GFP/sh cyclin B1及空載體。轉染0、24、48、72 h時采用酶聯免疫檢測儀測定各組光密度(OD)值，轉染48 h時采用Transwell小室檢測侵襲及轉移細胞數。結果 培養24、48、72 h時high cyclin B1組OD值均高于control cyclin B1組(P均<0.05)，cyclin B1 siRNA組均低于control siRNA組(P均<0.05)。培養48、72 h時high cyclin B1組OD值均高于cyclin B1 siRNA組(P均<0.05)。high cyclin B1組培養48 h時侵襲及轉移細胞數均高于control cyclin B1組及cyclin B1 siRNA組(P均<0.05)，cyclin B1 siRNA組侵襲及轉移細胞數均低于control siRNA組(P均<0.05)。結論 cyclin B1可促進神經膠質瘤細胞增殖、侵襲和轉移。

神經膠質細胞瘤；細胞周期素B1；細胞增殖；侵襲；轉移

神經膠質瘤是中樞神經系統最常見的腫瘤，約占所有顱內腫瘤的45%，其發病機制尚未明確[1,2]。研究發現，細胞周期改變在腫瘤發生、發展過程中具有重要作用[3～5]。生理狀態下，細胞周期素可調節正常的細胞周期進程，但在惡性腫瘤患者或動物體內其表達異常升高[6]。人細胞周期素B1(cyclin B1)是經典的細胞分裂期周期蛋白，在細胞由G2期向M期轉換過程中發揮重要作用[4]。Song等[4]研究發現，cyclin B1高表達與食管癌的侵襲和轉移有關。但其與神經膠質瘤關系的報道較少。2014年12月～2015年6月，本研究觀察了cyclin B1對神經膠質瘤細胞增殖、侵襲和轉移的影響。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 神經膠質瘤細胞U87MG購自協和醫科大學細胞庫；cyclin B1購自美國Santa Cruz公司；LipfectimineTM2000轉染試劑盒及載體pcDNA3.1 cyclin B1、pGCsi-U6/Neo/GFP/sh cyclin B1均購自美國Invitrogen公司；Transwell小室購自北京樂博生物科技有限公司。

1.2 細胞培養及分組處理 神經膠質瘤細胞U87MG置于含10%胎牛血清的MEM培養基中，37 ℃、5% CO2培養箱中培養，至細胞融合90%～95%時，隨機分為high cyclin B1組、control cyclin B1組和cyclin B1 siRNA組、control siRNA組。high cyclin B1組、control cyclin B1組瞬時轉染pcDNA3.1 cyclin B1及空載體，cyclin B1 siRNA組、control siRNA組瞬時轉染pGCsi-U6/Neo/GFP/sh cyclin B1及空載體。

1.3 細胞增殖檢測 將轉染24 h的各組細胞均按2 000個/孔接種于96孔板，每孔體積為200 μL，將培養板置于37 ℃、5% CO2孵箱中培養。培養0、24、48、72 h時采用酶聯免疫檢測儀測定各組光密度(OD)值，以OD值反映細胞增殖情況。

1.4 細胞轉移、侵襲能力檢測 將轉染48 h的各組細胞按1×105個/孔接種至Transwell小室，上室終體積為200 μL、下室終體積為800 μL，具體步驟參照試劑盒說明書。各組侵襲5 h，轉移4 h，甲醇固定30 min，結晶紫染色5 min，正置顯微鏡下拍照，計數侵襲及轉移細胞數。

2 結果

2.1 各組細胞增殖情況比較 見表1。

2.2 各組細胞侵襲和轉移能力比較 見表2。

3 討論

神經膠質瘤惡性程度高、轉移速度快，患者預后本研究通過構建cyclin B1高、低表達細胞株和空載對照細胞株，觀察了不同cyclin B1表達對神經膠質瘤細胞增殖、侵襲和轉移的影響。結果表明，高表達cyclin B1的神經膠質瘤細胞增殖、侵襲及轉移能力均強于低表達cyclin B1細胞，表明cyclin B1具有促進神經膠質瘤發生、發展的作用。細胞遷移是腫瘤轉移的關鍵[14]。Song等[4]報道，cyclin B1可增加食管內皮細胞和肺內皮細胞的遷移能力。Kang等[11]研究發現，cyclin B1/CDC2復合物激活可導致細胞核Lamins和Vimentin磷酸化，參與重組細胞核骨架與細胞骨架之間的纖維網，促進微細絲重組。由此推測，cyclin B1高表達可能通過改變神經膠質瘤細胞骨架，進而促進腫瘤細胞外滲，增加細胞的侵襲和轉移能力。

表1 各組細胞增殖情況比較±s)

注：與control cyclin B1組同時間點比較，*P<0.05；與control siRNA組同時間點比較，△P<0.05；與cyclin B1 siRNA組比較，#P<0.05。

表2 各組培養48 h侵襲及轉移細胞數比較(個，±s)

注：與control cyclin B1組比較，*P<0.05；與control siRNA組比較，△P<0.05；與cyclin B1 siRNA組比較，#P<0.05。較差。研究發現，神經膠質瘤細胞增殖、侵襲、轉移與基因突變、細胞周期失調等密切相關。cyclin B1是細胞周期素cyclin B家族的一員，其基因由9個外顯子和8個內含子組成。在細胞周期S期、G2期cyclin B1表達逐漸升高，在G2晚期表達量達到峰值，激活CDC2激酶，形成cyclin B1/CDC2復合物，通過裂解一系列底物蛋白，使細胞進入有絲分裂期，促進細胞由G2期進入M期。cyclin B1/CDC2復合物是推動細胞從DNA合成向有絲分裂轉換的動力[7]。有絲分裂促進因子(MPF)是精確調控有絲分裂的關鍵點，cyclin B1通過調節MPF活性而調節有絲分裂的起始和終止。cyclin B1合成、降解及亞細胞定位異常等均可導致MPF活性異常，引起細胞周期紊亂，細胞增殖異常，最終導致疾病的發生[8～11]。cyclin B1高表達可激活與其相關的CDC2激酶活性，取消G2/M期阻滯[5]，激活細胞有絲分裂，導致細胞過度增殖，促進腫瘤的發生、發展[8]。多種惡性腫瘤組織中可檢測到cyclin B1異常表達。Liu等[12]研究發現，非諾貝特可誘導頭頸部鱗狀細胞癌G2/M期阻滯和調亡，降低CDK1/cyclin B1激酶復合物活性可能是其作用機制。Calvisi等[13]發現，胃癌組織中cyclin B1表達增加，其表達量與淋巴結轉移有關。

總之，cyclin B1高表達可促進神經膠質瘤細胞的增殖、侵襲和轉移，但其作用機制有待進一步探討。

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孫煒(E-mail: sunwei7777@126.com)

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A

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2016-04-12)