外周血循環腫瘤細胞EGFR表達對晚期非小細胞肺癌患者TKI治療效果及預后的影響

江波，金從國，涂長玲，何文杰，楊承綱，李高峰

(云南省腫瘤醫院 昆明醫科大學第三附屬醫院，昆明650118)

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外周血循環腫瘤細胞EGFR表達對晚期非小細胞肺癌患者TKI治療效果及預后的影響

江波，金從國，涂長玲，何文杰，楊承綱，李高峰

(云南省腫瘤醫院 昆明醫科大學第三附屬醫院，昆明650118)

目的 探討外周血循環腫瘤細胞(CTC)表皮生長因子受體(EGFR)表達對晚期非小細胞肺癌(NSCLC)患者EGFR酪氨酸激酶抑制劑(TKI)治療效果及預后的影響。方法 選擇晚期NSCLC患者66例，從三種TKI類藥物(吉非替尼、厄洛替尼、鹽酸埃可替尼)中任選一種治療1個月。治療前隨機選取10例患者采集空腹靜脈血，采用流式細胞分選技術分選外周血CTC并驗證。采用流式細胞術檢測所有患者治療前及治療1個月外周血CTC EGFR表達，比較EGFR高表達者和低表達者的治療效果(有效率及控制率)及生存情況。結果 經流式細胞術分選的CD45-CK18+細胞光鏡下可見，其細胞核染色加深，染色質變粗，核質比增大，具備惡性腫瘤細胞特征，證實CD45-CK18+細胞為外周血CTC。66例晚期NSCLC患者中，EGFR高表達者30例、低表達者36例。EGFR高表達者和低表達者TKI治療有效率分別為53.3%(16/30)、27.8%(10/36)，控制率分別為80.0%(24/30)、44.4%(16/36)，兩者比較P均<0.05。EGFR高表達者和低表達者中位無進展生存期分別為11、4個月，中位總生存期分別為21、10個月，1年生存率分別為77.8%、63.3%，2年生存率分別為38.1%、31.2%，3年生存率分別為22.2%、3.3%，兩者比較P均<0.05。結論 外周血CTC中EGFR高表達的晚期NSCLC患者TKI靶向治療效果及預后均優于EGFR低表達者。

非小細胞肺癌；循環腫瘤細胞；表皮生長因子受體；酪氨酸激酶抑制劑

有研究顯示，無論是在腫瘤原發病灶切除前還是切除后，患者體內都可檢測到循環腫瘤細胞(CTC)[1～3]。CTC存在表皮生長因子受體(EGFR)信號傳導通路異常，如EGFR過度表達、EGFR突變等，可促進腫瘤細胞增殖并抑制其凋亡，導致生長調節失控[4]。近年來，分子靶向治療逐漸得到推廣，EGFR是目前研究最多的肺癌治療靶點。EGFR酪氨酸激酶抑制劑(TKI)是晚期非小細胞肺癌(NSCLC)的常用靶向治療藥物。本研究探討外周血CTC中EGFR表達對晚期NSCLC患者TKI治療效果及預后的影響。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2012年5月～2014年5月云南省腫瘤醫院收治的晚期NSCLC患者66例，男40例、女26例，年齡41～78歲；均經組織病理檢查明確診斷；病理類型：腺癌58例，鱗癌8例；TNM分期：Ⅲb期4例，Ⅳ期62例；功能狀態(PS)評分：0～1分44例，≥2分22例。納入標準：①組織病理檢查明確為NSCLC；②影像學檢查(CT或MRI)有可測量的病灶；③入組前未接受過TKI類藥物治療；④預計生存期>3個月；⑤無TKI治療禁忌證。排除標準：①組織病理檢查無法確診為NSCLC；②既往已進行TKI類藥物治療。

1.2 治療方法 30例患者口服吉非替尼250 mg，1次/d；10例患者口服厄洛替尼150 mg，1次/d；26例患者口服鹽酸埃可替尼125 mg，3次/d。療程均1個月。

1.3 外周血CTC分選及驗證 采用流式細胞分選技術。治療前隨機選取10例患者采集空腹靜脈血20 mL，肝素抗凝，將其分成20管，每管1 mL。每管均加入CD45-PC5、CK18-FITC各200 μL，避光保存30 min；加入氯化銨(NH4Cl)溶血素4 mL，反復溶血直到液體透亮，離心后加入培養液，流式細胞儀進行分選。設置SORT的左右收集細胞群，一般左側為CD45-CK18+細胞，右側為非CD45-CK18+細胞。根據要求設置收集數目為1 000個，同時在樣本收集處安裝分選試管，開始收集細胞。流速為10 000～25 000個/s，收集過程中需全程振蕩。將分選的CD45-CK18+細胞用玻片收集微球后，進行HE染色，光鏡下觀察細胞特征。

1.4 外周血CTC EGFR表達檢測 采用流式細胞術。66例患者于TKI類藥物治療前及治療1個月采集肘正中靜脈血5 mL。取5 mL無菌試管，加入 CD45-PC5、EGFR-PE和CK18-FITC各20 μL，然后加入肝素抗凝的外周靜脈血100 μL搖勻，避光室溫保存30 min。加入NH4Cl溶血素2 mL溶血，15 min后上流式細胞儀檢測，記錄外周血CTC EGFR表達。以外周血CTC EGFR表達的中位數作為界值，大于中位數定義為EGFR高表達，小于中位數定義為EGFR低表達。

1.5 療效評價及隨訪 ①療效評價：治療1個月后參照WHO實體瘤療效評價標準[5]評價療效，分為完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、疾病穩定(SD)、疾病進展(PD)，以CR+PR計算有效率，以CR+PR+SD計算控制率。②預后情況：治療后隨訪3年，記錄患者的無進展生存期(PFS)、總生存期(OS)和1、2、3年生存率。PFS指治療首日至病情進展的時間，OS指治療首日至死亡日或失訪日。比較EGFR高表達者和低表達者的有效率、控制率，中位PFS、中位OS和1、2、3年生存率。

2 結果

2.1 外周血CTC驗證 光鏡下可見，CD45-CK18+細胞核染色加深，染色質變粗，核質比增大，具備惡性腫瘤細胞特征，證實CD45-CK18+細胞為外周血CTC。見插頁Ⅲ圖10。

2.2 EGFR高表達者和低表達者療效比較 66例晚期NSCLC患者中，EGFR高表達者30例、低表達者36例。30例EGFR高表達者CR 2例、PR 14例、SD 8例、PD 6例，有效率為53.3%(16/30)，控制率為80.0%(24/30)；36例EGFR低表達者CR 0例、PR 10例、SD 6例、PD 20例，有效率為27.8%(10/36)，控制率為44.4%(16/36)；EGFR高表達者有效率及控制率均高于EGFR低表達者(P均<0.05)。

2.3 EGFR高表達者和低表達者預后比較 EGFR高表達者和低表達者中位PFS分別為11、4個月，中位OS分別為21、10個月，1年生存率分別為77.8%、63.3%，2年生存率分別為38.1%、31.2%，3年生存率分別為22.2%、3.3%。EGFR高表達者中位PFS、中位OS和1、2、3年生存率均高于EGFR低表達者(P均<0.05)。見圖1、2。

圖1 EGFR高表達和低表達者PFS比較

圖2 EGFR高表達和低表達者OS比較

3 討論

EGFR是NSCLC治療的一個重要靶點，針對該靶點的治療藥物已在臨床上廣泛應用，是目前臨床靶向治療用藥的一個研究熱點。臨床研究證實，TKI類藥物治療EGFR突變型NSCLC患者的有效率為65%～83%，而對野生型患者的有效率為10%～15%[6]。因此，NCCN指南已把EGFR基因突變陽性作為應用TKI類藥物的先決條件。目前在中國獲批用于臨床的TKI類藥物有吉非替尼、厄洛替尼及鹽酸埃克替尼。在分子結構上，三種藥物均含有喹唑啉母環的基本結構，其中厄洛替尼與鹽酸埃克替尼的差別僅在側鏈的開環與閉環；在藥代動力學上，吉非替尼與厄洛替尼的半衰期較鹽酸埃克替尼更長，因此服藥時間有所差異(吉非替尼和厄洛替尼為每天1片，鹽酸埃克替尼為每天3片)；在療效上，三種藥物的客觀緩解率、PFS及療效均無明顯統計學差異[7～14]。因此，本研究對治療藥物的選擇未進行強行規定，任意一種TKI類藥物治療的晚期NSCLC患者即可納入研究。

臨床上檢測EGFR突變的方法有很多，但每種檢測方法均依賴于組織標本[7]。目前多數NSCLC患者EGFR基因突變檢測均以手術切除的肺癌組織作為檢測標本，此時患者多處于早期而未進行靶向治療，而晚期患者又很難獲得足量標本。晚期NSCLC的一線治療中，40%～50%的NSCLC患者能從TKI靶向治療中獲益，如何從無法獲取足量組織標本的患者中篩選出適合TKI靶向治療者是臨床醫生所面臨的問題。理論上負載腫瘤細胞、基因或蛋白的標本均有可能成為腫瘤組織的替代物，如外周血，其取材方便、標本來源充足。有研究顯示，以晚期NSCLC患者外周血CTC和血漿為標本，其EGFR突變的檢出率分別為92%和33%，提示CTC可能是更好的組織替代標本。研究發現，接受TKI類藥物治療的NSCLC患者CTC攜帶的基因信息與腫瘤組織具有高度一致性[7]。目前針對外周血CTC及組織標本進行EGFR突變檢測的研究較多，但對其EGFR表達的相關研究報道極少[15，16]。因此，本研究以晚期NSCLC患者的外周血為檢測標本。

本研究結果顯示，晚期NSCLC患者EGFR高表達者有效率及控制率均明顯高于EGFR低表達者。說明EGFR高表達者進行TKI類藥物靶向治療的效果優于EGFR低表達者，臨床對晚期NSCLC患者可依據CTC的EGFR表達水平判斷是否行TKI類藥物治療，該方法可能對無法進行組織EGFR突變檢測的患者是一種有效補充。同時本研究發現，EGFR高表達者中位PFS、中位OS和1、2、3年生存率均明顯高于EGFR低表達者，表明EGFR高表達的晚期NSCLC患者經TKI類藥物靶向治療后預后更好。

綜上所述，外周血CTC中EGFR高表達的晚期NSCLC患者TKI靶向治療的效果及預后均優于EGFR低表達者。提示檢測外周血CTC中的EGFR表達水平有助于臨床篩選適合接受TKI靶向治療的晚期NSCLC患者，從而提高治療效果。

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李高峰(E-mail： ligaofenghl@126.com)

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2016-01-04)