阿司匹林抵抗的動脈粥樣硬化缺血性腦卒中患者COX-2基因啟動子區-765G/C多態性觀察

陳建昌，孫其中，郝躍偉

(1山東大學附屬省立醫院，濟南250022；2山東省醫學影像學研究所)

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阿司匹林抵抗的動脈粥樣硬化缺血性腦卒中患者COX-2基因啟動子區-765G/C多態性觀察

陳建昌1，孫其中2，郝躍偉1

(1山東大學附屬省立醫院，濟南250022；2山東省醫學影像學研究所)

目的 觀察阿司匹林抵抗(AR)的動脈粥樣硬化缺血性腦卒中患者環氧化酶2(COX-2)基因啟動子區-765G/C的多態性，探討COX-2基因啟動子區-765G/C的多態性與AR發生的關系。方法 服用阿司匹林治療的動脈粥樣硬化缺血性腦卒中患者313例，其中AR 26例(AR組)、阿司匹林半抵抗(ASR)54例(ASR組)、阿司匹林敏感(AS)233例(AS組)。采用real-time PCR法觀察三組COX-2基因啟動子區-765G/C多態性。結果 AR組COX-2基因啟動子區-765位點GG基因型頻率為46.2%、GC為38.5%、CC為15.4%；ASR組GG基因型頻率為48.1%、GC為42.6%、CC為9.3%；AS組GG基因型頻率為76.0%、GC為21.5%、CC為2.6%；AR組G等位基因頻率為65.4%、C等位基因頻率為34.6%，ASR組G等位基因頻率69.4%、C等位基因頻率30.6%，AS組G等位基因頻率86.7%、C等位基因頻率13.3%。AR組、ASR組COX-2基因啟動子區-765位點GC、CC基因型頻率和C等位基因頻率均高于AS組(P均<0.01)。結論 存在AR和ASR的動脈粥樣硬化缺血性腦卒中患者COX-2基因啟動子區-765位點GC、CC基因型和C等位基因頻率高于AS患者；COX-2基因啟動子區-765G>C可能與AR的發生有關。

環氧化酶2；基因多態性；單核苷酸多態性；阿司匹林；缺血性腦卒中；動脈粥樣硬化

阿司匹林可有效抑制血小板活化及聚集，防止血栓形成，是腦血管病一級和二級防治的常用藥物[1]。然而部分患者常規劑量甚至高劑量服用阿司匹林不能有效抑制血小板聚集，仍有一定的血管不良事件發生率，因此有學者[2～5]提出了“阿司匹林抵抗(AR)”的概念，AR的患者不能在阿司匹林防治心血管病中獲益。AR發生的原因及機制不甚清楚，推測可能的內源性因素有環氧化酶2(COX-2)基因多態性等[6,7]。COX-2可以誘導花生四烯酸轉化成前列腺素E2，進而轉化成血栓素A2。阿司匹林可以抑制上述過程。COX-2基因的-765G/C位點位于啟動子區域，突變可影響啟動子活性而改變COX-2的表達，此位點突變是否與AR的發生有關目前鮮有報道。為此，本研究觀察了AR動脈粥樣硬化缺血性腦卒中患者COX-2基因啟動子區-765G/C的多態性，探討COX-2基因啟動子區-765G/C的多態性與AR發生的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2013年4月～2015年8月在山東省立醫院西院住院治療的動脈粥樣硬化缺血性腦卒中患者313例，男192例、女121例，年齡(67±11)歲。患者均按醫囑規范服用阿司匹林100 mg/d超過20 d。AR或阿司匹林半抵抗(ASR)判定標準[3]：取空腹靜脈血3 mL，采用全血電阻法，應用配套的二磷酸腺苷(ADP)和膠原(COL)為誘導劑，測定血小板聚集率，即電阻抗值，同時滿足ADP誘導的電阻抗值>13 Ω、COL誘導的電阻抗值≥18 Ω兩個條件者判定為AR，滿足其一者為ASR，均不滿足者為阿司匹林敏感(AS)。排除近4周使用其他抗血小板、抗凝和非甾體抗炎藥物者。313例中，AR 26例(AR組)，ASR 54例(ASR組)，AS 233例(AS組)。三組在年齡、性別構成、BMI、合并糖尿病和高脂血癥方面差異無統計學意義。AR組、ASR組合并原發高血壓比例高于AS組(P均<0.01)。詳見表1。

1.2 COX-2基因啟動子區-765G/C多態性觀察 采用real-time PCR法。采集三組空腹外周靜脈血2 mL，存儲于EDTA抗凝管中，抽提基因組DNA。PCR引物序列參照文獻[8,9]設計。引物由上海生工生物技術有限公司合成，等位基因特異引物AS1序列為5′-GCGGGCTCCTTGTTTCTTGGAAAGAGATGG-3′，AS2序列為5′-GCGGGCAGGGCGGCTCCTTGTT-TCTTGGAAAGAGATGC-3′，共同引物CP序列為5′-AGGGTAACTGCTTAGGACCAGTATTATGAGGAG-3′。PCR反應體系為15 μL，包括基因組DNA為1 μL，三種引物每種0.2 μmol/L，AmpliTaq DNA Polymerase 1.8 U，Tris-HCl 10 mmol/L，氯化鉀40 mmol/L(pH 8.0)，氯化鎂2 mmol/L，dATP、dCTP、dGTP各50 μmol/L，dTTP 25μmol/L，dUTP 75 μmol/L，0.2× SYBR Green Ⅰ、5%二甲基亞砜(DMSO)、2.5%甘油、ROX 染料0.25 μmol/L，不足15 μL的部分由雙蒸水(dH2O)補足。PCR反應條件：95 ℃ 12 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40個循環，分析熔解曲線。

表1 三組一般資料比較

1.3 統計學方法 采用SPSS16.0統計軟件。計數資料比較采用χ2檢驗；用LDA軟件進行連鎖不平衡狀態分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

COX-2基因-765G/C的基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05),具有群體代表性。AR組COX-2基因啟動子區-765位點GG基因型頻率為46.2%、GC為38.5%、CC為15.4%,ASR組GG基因型頻率為48.1%、GC為42.6%、CC為9.3%,AS組GG基因型頻率為76.0%、GC為21.5%、CC為2.6%,AR組G等位基因頻率為65.4%、C等位基因頻率為34.6%，ASR組G等位基因頻率69.4%、C等位基因頻率30.6%，AS組G等位基因頻率86.7%、C等位基因頻率13.3%。AR組、ASR組COX-2基因啟動子區-765位點GC、CC基因型頻率和C等位基因頻率高于AS組(P均<0.01)。

3 討論

阿司匹林是動脈粥樣硬化缺血性腦卒中防治中最常用的藥物[10]，目前AR的發生率為8%～45%[11,12]，可能與藥物劑量及基因多態性等[6,7]有關。COX是前列腺素合成的重要限速酶，分為COX-1和COX-2。COX-1表達于所有組織細胞，參與機體正常的生理功能；COX-2在生理狀態下較少表達，但在多種病理因素(如炎癥介質、激素、細胞因子等)誘導下可高表達。COX-2的產物前列腺素在炎癥及粥樣硬化斑塊破裂中發揮重要作用[13～16]。常規劑量阿司匹林對COX-2的抑制作用微弱，可能導致AR的發生。研究[17]表明，COX-2基因啟動子區-765G/C突變可改變啟動子活性而影響基因表達，可能成為個體發生AR的一個因素。

本研究結果顯示，AR組、ASR組COX-2基因啟動子區-765位點GC、CC基因型及C等位基因頻率均高于AS組，與國內外一些報道結論相同，提示C等位基因攜帶者有較高幾率發生AR，從而增加腦血管事件的發生率。楊蓉等[18]研究發現AS組與AR組等位基因C頻率有差異，推斷等位基因C可促進COX-2的表達，使得血栓素A2生成增加、血小板激活，影響阿司匹林的抗血小板功能，導致AR的發生。也有一些學者[19]得出了相反結論，但該研究納入樣本量較少，可能對結果有一定影響。Takahashi等[20]研究結果顯示冠心病患者發生AR與COX-2基因啟動子區-765G>C并無顯著關系，推測可能存在其他的分子生物學機制。出現這種差異，可能是由于各獨立研究者選取的人群、種族不同以及樣本量的較大差異導致的。

綜上可見，COX-2基因啟動子區-765G>C可能與AR的發生有關，但未來仍需要進行多中心、更大樣本量的研究以及進一步功能試驗來驗證上述結論。

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