全細胞催化PET生物降解性能的研究

王宏陽，鞏繼賢，李育強，張健飛

(1. 天津工業大學紡織學院，天津 300387；2. 天津工業大學先進紡織復合材料教育部重點實驗室，天津 300387)

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全細胞催化PET生物降解性能的研究

王宏陽1,2，鞏繼賢1,2，李育強1,2，張健飛1,2

(1. 天津工業大學紡織學院，天津 300387；2. 天津工業大學先進紡織復合材料教育部重點實驗室，天津 300387)

生物催化作為生物技術的一個重要發展方向，在材料加工和處理方面開始發揮越來越重要的作用。針對全細胞對高聚物PET的生物降解過程開展研究，以PET為碳源，通過檢測菌株的生物量的變化、發酵液中產物的種類與濃度變化，以及PET降解前后結晶度的影響和粒徑的變化，研究全細胞對PET的降解過程。結果表明，全細胞對PET有一定的降解能力，PET在降解后的粒徑變小，結晶度升高，降解過程產生多種中間物質。

全細胞 生物降解 粒徑

PET(聚對苯二甲酸乙二醇酯)在自然界中預測其存在周期為16年到48年，被認為是比脂肪族聚酯更難生物降解的芳香族聚酯[1]。當前，生物催化降解已經從以傳統的小分子作為底物的研究，擴展到能夠以高分子聚合物作為底物的生物降解。由于PET具有優良的物理和化學性能，被廣泛的應用于各個行業，其廢棄物的累積已經成為一個全球關注的熱點。

國內外科研工作者從小分子對苯二甲酸(Terephthalate acid，TA)[2, 3]研究，到以對苯二甲酸二乙酯(Diethyl terephthalate，DTP)[2, 4]和3PET[5]等PET模擬物和脂肪族-芳香族共聚物[6]作為底物探究PET的生物降解能力，并取得了一定的成果。然而直接以PET為底物，因酶的特性和PET自身結構性能的限制，生物降解效果不理想。本文為研究全細胞對PET顆粒的降解性能，以PET為唯一碳源進行生長的分解菌為出發菌株，通過菌株生物量的變化、發酵液中產物種類與濃度變化，分析了底物顆粒降解前后結晶度的變化以及底物粒徑對菌株的生長和降解過程的影響。

1 實驗部分

1.1 菌株

睪丸酮叢毛單胞菌，天津工業大學紡織學院生態染整課題組培育。

1.2 試劑與藥品

PET切片(西格瑪奧德里奇中國公司)；對苯二甲酸(terephthalicacid，TA)(天津市光復精細化工研究所)；苯甲酸(benzoic acid，BA)(天津市化學試劑三廠)；雙(2-羥基乙基)對苯二甲酸酯(bis(2-hydroxyethyl)terephthalate，BHET)、原兒茶酸(protocatechuic acid，PA)(天津市希恩斯生化科技有限公司)；粘康酸(muconic acid，MA)(阿法埃莎化學有限公司)；磷酸、甲醇(天津科密歐化學試劑有限公司)。

1.3 儀器與設備

HZQ-Q型全溫振蕩器(哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司)；WND-100型高速中藥粉碎機(浙江省蘭溪市偉能達電器有限公司)；LC-15C型反向高效液相色譜儀(HPLC)(日本島津有限公司)；LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌鍋(上海申安醫療器械廠)；V-1200型可見光分光光度計(上海美譜達儀器有限公司)；DL-101-2ES型電熱鼓風干燥箱(天津市中環實驗電爐有限公司)；D8 DISCOVER GADDS型X射線衍射儀(XRD)(德國Bruker AXS公司)；掃描電鏡TM-1000(日本日立)。

1.4 實驗方法

1.4.1 PET超細粉體顆粒的制備

取一定量PET切片，150℃烘干36h，充分干燥，轉入高速中藥粉碎機粉碎加工，再用360目標準篩網過篩制得。

1.4.2 PET分解菌培養降解

培養基的配制參照文獻方法[7]：準確稱取NH4Cl 1g、KH2PO43g、Na2HPO47g、NaCl 0.5g、MgSO4·7H2O 0.25g、H3BO30.5μg、FeCl3·6H2O 0.2μg、MnSO4·5H2O 0.4μg、ZnCl20.4μg、CuSO4·5H2O 40μg、(NH4)6Mo7O24·7H2O 0.2μg及水1000mL，充分溶解后量取100mL加入到500mL錐形瓶中，120℃滅菌20min。

菌株的培養：稱取0.1g PET粉末添加到滅菌后培養基中，轉接20mL出發菌株培養液，37℃，140rpm/min振蕩培養，定期取樣測試。

1.5 測試方法

1.5.1 生物量的檢測

通過可見分光光度計測量微生物發酵液的光密度(OD值，optical density)來表示菌液的濃度，即每隔一定時間將菌株搖瓶取出，靜置4～6min，取錐形瓶中部發酵液3mL置比色皿中，觀察可見分光光度計波長為600nm的吸光度。

1.5.2 發酵液中產物的檢測

培養過程中每隔一定時間取樣2mL留做高效液相色譜測試。色譜條件：色譜柱：InertSustain C18反相柱(250mm×4.6mm，5μm)；柱溫：40℃；流速：1mL/min；進樣體積：1μL；檢測波長：240nm；流動相pH為2.02的60% CH3OH-0.05mol/L KH2PO4(V/V)緩沖溶液。

1.5.3 X射線衍射

采用德國Bruker AXS公司的D8 DISCOVER GADDS型X射線衍射儀對經過菌株處理前后的不同粒徑PET粉末的結晶行為進行分析。2θ范圍設為(4～40)°。

1.5.4 粒度分布測試

采用Delsa Nano C粒徑分析儀(BECKMEN COULTER)，乙醇分散體系。將PET樣品分散在乙醇溶液中，超聲震蕩5min，待粉末分散均勻后取出待測。

2 結果與討論

2.1 分解菌利用PET的生長特征

底物的分解和攝入為菌株的生長代謝提供碳源，生長情況也反映出菌株對底物的利用效率。PET超細粉末，作為底物進行PET分解菌的培養。菌株生長情況能夠表示微生物對底物的利用率，但這對高聚物底物的生物催化分解情況，只是間接的反映。底物對菌株生長的影響情況如圖1所示。

圖1 PET分解菌的生長曲線

圖1所示的結果表明，PET粉末作為底物被菌株分解，整個生物量呈現出波動的變化。不能像葡萄糖等可溶性小分子類常規底物能夠被微生物直接攝入細胞內，而進入代謝系統。是因為PET這樣的不溶性高聚物作為底物，不能直接被細胞利用。研究指出[3, 4]，在以聚酯類物質作為底物的生物過程中，首先需要細胞分泌出一定的胞外酶。在酶的催化作用下，聚合物的大分子鏈發生化學鍵的斷裂和分解。隨著生物催化分解反應的進行，會陸續產生短鏈物質。當分子鏈足夠短的時候，這些分解產物就可以溶解在發酵液中，成為可溶性物質。這些可溶性小分子產物可以被細胞攝入，參與細胞內的代謝過程。

2.2 PET分解中間產物的變化

為獲得微生物培養條件下，PET生物催化分解的直接信息，PET超細粉末作為底物，進行PET分解菌的培養，培養一定時間后對發酵液取樣分析，得到不同時刻發酵液樣品的HPLC譜圖。結果如圖2所示：

圖2 不同時刻發酵液中PET分解中間產物的液相色譜

如圖2所示，全細胞降解PET不同時刻的發酵液的液相色譜圖譜，與其他酶制劑降解PET相比，菌株降解PET底物的中間產物種類更加豐富。由圖2可知，隨著培養時間的延長，PET分解出中間產物的變化并不是成線性積累增加，而是產生了一定的波動現象，在培養至24h后產物濃度達到一定高水平，48h處又降低到低水平，最后在72h處又開始增加，這些波動變化足以說明菌株全細胞作用PET更加復雜，中間產物之間的分解關系更加復雜。通過對比標準物質出峰時間，我們發現在實驗色譜條件下，發酵液中的主要產物為保留時間(retention time，rt)為rt=3.28min的MA、rt=6.33min的BA以及rt=4.01min處出峰，推測是以對苯二甲酸為主的物質(TA-m)(TA、3-羥基苯甲酸、BHET)。通過HPLC譜圖可知，在菌株培養過程中，MA、BA、TA-m這些物質所形成的峰面積比較大，即這些物質在發酵液中的濃度相對較大。隨著培養時間的延長，PET的分解產物濃度變化幅度明顯不同，其中MA和TA-m的濃度一直相對較大，說明微生物對PET的降解產物作用主要集中在MA和TA-m的降解利用上。

對于高聚物的生物轉化作用來說酶的催化效率是一個限制性因素，即便在全細胞的生物催化過程中。據相關報道[8]，某種中間產物在酶濃度較低的情況下不能被分解，當過量的酶存在時能夠被很好地分解。本研究中伴隨著微生物的生長繁殖，發酵液中胞外酶的濃度提高，可以顯著提升PET降解的效率，而傳統單一酶制劑會隨著分解作用的發生而逐漸消耗。全細胞生物能夠分泌各種各樣的復合酶，借助于這些復合的酶催化PET底物產生各種各樣的中間產物，因此全細胞生物加工PET的過程中會產生種類豐富的中間產物。

2.3 分解菌對PET結晶度的影響

根據文獻報道[9]，經過酶處理的PET結晶度顯著提高，說明大分子的非晶區更容易受到酶分子的作用而發生降解作用。而我們采用菌株發酵液對粒徑小于25μm的PET顆粒進行三周的降解處理，定期補加新鮮菌液，最后收集底物粉末進行XRD測試。測試結果如圖3所示：

圖3 PET經菌株處理前后的XRD變化

圖3中兩條曲線分別代表降解菌對PET顆粒處理前后的XRD曲線，可以明顯，曲線的衍射峰出峰位置和形狀基本沒有變化，這說明物質本身并沒有發生晶體結構的變化。但是，經過菌株處理的樣品衍射峰的強度有所增加。同時通過對譜圖的數據處理分析發現，經過三周菌株處理，PET顆粒的結晶度增大了5.03%。由此可知：菌株對PET顆粒有一定的降解作用，主要集中在分子鏈運動相對活躍的無定形區域發生有效分解，從而導致PET顆粒結晶度增加。

2.4 分解菌對PET粒徑結構的影響

納米顆粒的尺寸與酶分子尺寸之間的比率會影響酶對其吸附行為，進而影響催化降解效果。為研究菌株對PET顆粒的降解作用，本實驗對菌液處理前后的較小粒徑的PET顆粒進行粒徑測試，結果如圖4所示：

圖4 PET生物降解前后的粒徑分布變化

由圖4可知底物PET顆粒的直徑分布較為廣泛(100nm～1500nm)，而酶分子的尺寸約為10nm，遠大于酶分子直徑，因此酶分子只能隨機吸附在PET顆粒表面。當底物尺寸與酶分子的比率越大，則酶分子對底物的有效覆蓋面積越小；當底物尺寸與酶分子的比率越小，則酶分子對底物的有效覆蓋面積越大。酶分子越是充分覆蓋PET底物，降解效率就越高。實驗中，經過菌液處理后的PET顆粒粒徑集中于較窄的分布范圍，說明酶分子作用于底物表面使得PET尺寸減小。分析主要原因是PET顆粒結晶程度較低，非晶區結構占據主要，較大顆粒PET經過酶分子的吸附后，只在某個部位產生催化降解，使得PET表面碎片化，進而直徑減小；而粒徑較小時，酶分子對PET顆粒的有效覆蓋面積增加，對其催化降解程度提高，所以分解較為充分。推測全細胞生物降解PET屬于剝皮式降解。

2.5 分解菌的全細胞生物催化過程

圖5 全細胞生物催化PET的生態體系

圖5展示了全細胞生物催化PET的整個生態體系。首先，PET降解菌在底物碳源的刺激下分泌出多種胞外酶，酶分子吸附在PET顆粒表面，大分子鏈發生化學鍵的斷裂。隨著生物催化分解反應的進行，會陸續產生短鏈物質。當分子鏈足夠短的時候，這些分解產物就可以溶解在發酵液中，成為可溶性物質。最終這些可溶性小分子產物被細胞攝入，參與細胞內的代謝過程，促進菌株的生長繁殖。

3 結論

全細胞生物催化PET降解過程中，菌種能夠以PET為唯一碳源進行生長，降解過程更為復雜，能夠催化降解PET多種分解產物。同時PET顆粒在經過三周處理后其結晶度增大了5.03%，由于PET非晶區域高分子鏈段相對較為活躍，降解行為容易發生，從而導致結晶度增大。底物的PET超微顆粒的粒徑結構在菌株處理后，其顆粒的粒徑有所減小，表明PET具有生物分解性能，分解產物能夠促進菌株生長。從全細胞角度分析，聚酯生物分解過程比直接用酶處理底物更復雜，因此對菌株、酶、PET和產物四者作用體系的研究還較為緩慢，主要原因是缺乏對高聚物PET高效降解的菌株。

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Research on Whole-cell Catalyzed PET Biodegradability

WANGHong-yang1,2,GONGJi-xian1,2,LIYu-qiang1,2,ZHANGJian-fei1,2

(1. College of Textile, Tianjin Polytechnic University, Tianjin 300387; 2. Key Laboratory of Advanced Textile Composites of Ministry of Education,Tianjin Polytechnic University, Tianjin 300387)

As an important development direction of biotechnology, biocatalysis plays a more and more important role in material processing and handling. The research aiming at the biodegradation process of whole-cell to PET(poly(ethylene terephthalate)) was carried out. Taking PET as carbon source, by detecting the biomass change of strain, the species kinds of products in fermented liquid and concentration change, the influence of PET crystallinity and change of particle size before and after degradation, the degradation process of whole-cell to PET was studied. Results showed that whole-cells had certain degradability to PET, the particle size became smaller and crystallinity became higher after degradation of PET, and a variety of intermediate substances were produced during the degradation process.

whole-cell biodegradation size

2016-08-17

王宏陽(1990-)，男，博士研究生，研究方向：聚酯材料的生物改性。

O63，Q819

A

1008-5580(2016)04-0028-05