雙功能試劑與螯合金屬元素標記多肽新技術的建立

田慧芳+徐慶春+丁慧榮+田志華+張宏+朱華+王昕+沈靖

摘要 建立了雙功能試劑2-[（4-異硫氰基苯基）甲基]-1，4，7，10-四氮雜環十二烷-1，4，7，10-四乙酸（p-SCN-Bn-DOTA）與標準肽段反應的新方法，測定了反應產物與鑭系金屬Eu的螯合效率，探索了其作為靶向探針和蛋白定量標記試劑性能。考察了不同緩沖體系的濃度及pH值、p-SCN-Bn-DOTA量與肽段相對量、反應體系中有機相與水相比例，反應溫度與反應時間對偶聯效率的影響。實驗結果顯示： p-SCN-Bn-DOTA量為肽段的32倍，緩沖體系為0.2 mol/L TEAB （pH 8.5），60℃反應60 min， 有機相與水相之比為4.4∶1（V/V）時標記效率高；在HCl/NaAc緩沖體系（pH 4.0）中60℃反應60 min，金屬離子鰲合反應效率高達94%。本研究建立了一種新的基于雙功能試劑p-SCN-Bn-DOTA的標記方法，并成功用于RGD肽等的標記。

關鍵詞 雙功能試劑； 標記； 多肽； 蛋白定量； 質譜

2015-10-03收稿； 2016-03-11接受本文系北京市自然科學基金（Nos. 7143172， 7143173）資助

E-mail： shenjing69@sina.com

1 引 言

雙功能試劑連接多肽并螯合金屬元素，可以作為靶向探針結合分子影像技術用于腫瘤的靶向治療研究[1]，還可以通過標記多種金屬元素制備蛋白質組學多重定量試劑[2]，用于腫瘤標志物的篩選、鑒定、分類等研究。因此雙功能試劑在腫瘤研究方面具有良好的應用前景。

RGD肽是一類含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp）序列的短肽，基于靶向多肽RGD進行放射性核素標記可用于αvβ3（+）腫瘤的無創性檢查以及判斷患者是否適用于抗腫瘤血管形成治療[3～5]。此外，標記的小分子多肽具有生物相容性好、穿透性強、免疫原性低、作用快、易于實時監測的特點，可在基于靶向探針的蛋白的分析檢測方面發揮獨特優勢[6，7]。

在腫瘤蛋白質組定量分析研究方面，目前已開發的方法有基于穩定同位素標記的方法，如ICAT[8]、18O酶切標記[9]、SILAC[10] 、iTRAQ [11]等，但這些方法普遍存在同位素價格昂貴、標記難度較大、對質譜分析儀器具有選擇性、同位素峰在質譜分析時會發生相互干擾等缺點，會給定量結果帶來誤差[12]。因此探索非同位素標記的方法，開發具有我國自主知識產權的蛋白定量試劑具有重要意義。文獻[13～15]報道了針對肽段半胱氨酸標記設計的金屬編碼親和標簽。徐明等[16]利用外源Hg標簽標記硒蛋白/多肽，實現Se-Hg雙元素標記選擇性識別和檢測硒蛋白/多肽。但是在實際的蛋白質組學樣本分析中，需要使用適用于所有肽段的標記方法。Liu等[17]開發了基于雙功能試劑二乙酸胺五乙酸的標記方法，實現了肽段的無歧視標記，但所選擇的雙功能試劑標記效率不高。針對此問題，Wang等[18]用羥基琥珀酰亞胺-四氮雜環十二烷四乙酸（DOTA-NHS-ester） 作為螯合試劑進行了初步研究，在此基礎上，文獻[12，19]對標記方法進行了優化，提高了金屬標記效率。

雖然非同位素標記的方法已取得了進展，但是仍有以下幾方面需要改進。首先，DOTA-NHS-ester 容易水解，在反應體系中，活化酯與NH2的標記反應和水解反應互相競爭，不利于反應體系中水相和有機相組成的確立。其次，肽段中NH2與DOTA-NHS-ester是親核取代反應，反應體系應在中性或偏堿性條件進行；而DOTA-NHS-ester 在堿性條件下極易水解，水解產生酸，在一定程度上改變反應體系的pH值[20]。因此，DOTA-NHS-ester的水解敏感性高不利于確立標記反應條件，對實際樣本分析條件的限制很大，因此優化雙功能試劑的意義重大。

2-[（4-異硫氰基苯基）甲基]-1，4，7，10-四氮雜環十二烷-1，4，7，10-四乙酸（p-SCN-Bn-DOTA）是一種被廣泛應用的雙功能螯合試劑，如與牛血清白蛋白（BSA）和雞蛋清溶菌酶標記可用于腫瘤的檢測[21]，與利妥昔單抗[22]或核糖核酸[23]反應標記可以用于抗腫瘤藥的生物分布和顯影的研究，還可以與聚乙二醇[24]標記得到膠束用于制劑研發等。它的化學結構較DOTA-NHS-ester穩定，不易發生水解反應，這對于標記反應條件的確立十分有利，并可以通過螯合金屬離子標記氨基多肽。基于p-SCN-Bn-DOTA的標記方法的建立不僅有望開發一種新型的金屬標記試劑，用于腫瘤蛋白質組學的多重定量分析，而且可將該試劑用于RGD肽的標記，從而有利于腫瘤受體顯像劑的開發。本研究建立了基于雙功能試劑p-SCN-Bn-DOTA的螯合金屬元素標記多肽新技術，并成功標記RGD等標準肽段。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

Ultraflex II基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜儀（MALDI-TOF-MS，德國布魯克公司）；Discovery DV215CD分析天平（美國OHAUS公司）；HQ-60渦旋混勻器（北方同正生物技術發展有限公司）；PMC-060掌上離心機（日本TOMY公司）。

α-氰基-4-羥基肉桂酸（德國布魯克公司）；標準合成肽段 LGEYGFQNALIVR由吉爾生化（上海）有限公司合成；RGD肽由北京中海康醫藥科技發展有限公司合成；三乙二胺碳酸鹽（TEAB）、氯化銪（EuCl3）（美國Sigma-Aldrich公司）；p-SCN-Bn-DOTA（美國 Macrocyclics 公司）；其它試劑均為國產分析純；實驗用水為Milli-Q（美國Millipore公司）超純水。

2.2 實驗方法

2.2.1 p-SCN-Bn-DOTA與標準肽段的偶聯反應 100 μL 0.5 μmoL p-SCN-Bn-DOTA溶于二甲基甲酰胺（DMF）， 50 μL 0.68 μmoL肽段LGEYGFQNALIVR溶于TEAB。將兩種溶液以不同比例混合進行偶聯反應，考察TEAB的濃度和pH值、DOTA與肽段的摩爾比、反應溫度、反應時間等條件對偶聯效率的影響。其中肽段的終濃度始終為0.05 nmol/μL。稱取RGD肽 1 mg， 加DMF 124 μL，供p-SCN-Bn-DOTA與RGD肽的偶聯反應。

2.2.2 偶聯產物與金屬離子的螯合反應

向2.2.1中的反應體系加入5 μL 0.1 mol/L EuCl3溶液（鹽酸-乙酸鈉緩沖液或乙酸-乙酸銨緩沖液），再分別加入相應的不同pH值的緩沖液50 μL，考察pH值、反應溫度、反應時間對螯合效率的影響。

2.2.3 MALDI-TOF-MS分析 （1）干點法點樣 取1 μL分析樣品點于Ground steel靶板上，自然干燥后，再點5 mg/mL CHCA基質溶液（0.1%TFA-50%乙腈溶液）1 μL，自然干燥后進行質譜分析。（2）薄層法點樣 先在靶板上點0.5 μL CHCA基質的乙醇過飽和溶液，自然干燥后，再點1 μL CHCA基質溶液（5 mg/mL，0.1% TFA-50% 乙腈溶液）和樣品的混合溶液。采用Peptide Calib standard mono 作為標準品校正，相對標準偏差≤5 ppm。質譜數據采集采用反射模式。儀器控制軟件為FlexControl software verion 3.0，數據處理軟件為FlexAnalysis software verion 3.0。

3 結果與討論

3.1 雙功能試劑的選擇

目前針對巰基的金屬元素標記方法較多，標記氨基的金屬元素標記方法研究較少，已有的標記N-端氨基的方法有轉氨法等，如先將蛋白的游離N-端氨基轉化為活性的羰基，然后與連有肼的熒光基團反應得到標記分子[25] 。氨基的金屬標記，理論上可以標記所有的肽段，對所有的肽段和蛋白質（含巰基和不含巰基的）都能進行定量研究[2，20，26，27]。p-SCN-Bn-DOTA是一種雙功能螯合試劑，可與肽段的氨基共價結合，并通過絡合反應螯合金屬離子，與Wang等[18]采用的DOTA-NHS-ester相比，其結構穩定，不易水解，既能夠明確反應體系中水相和有機相的比例，又有利于確定反應體系的pH值，這些均利于標記反應條件的確立。

3.2 金屬元素和標準肽段的選擇

p-SCN-Bn-DOTA可與多種稀土金屬離子形成螯合物，其中與鑭系金屬離子形成的螯合物穩定性最佳[28]，故選鑭系金屬離子Eu作為螯合標簽。

標準肽段的選擇應具有典型性，由于實際的生物樣本大多是通過胰酶酶解成肽段，肽段C端是精氨酸（R）或者賴氨酸（K），故選用常用的標準蛋白牛血清白蛋白的胰酶酶解肽段LGEYGFQNALIVR作為標準肽段之一；RGD肽由于在腫瘤診斷和治療中的重要意義而被選作為標準肽段。

3.3 肽段的金屬元素標記反應原理

肽段的金屬元素標記反應的原理如圖1所示，首先是肽段的氨基與p-SCN-Bn-DOTA發生共價反應，反應產物再與鑭系金屬元素形成穩定螯合物。

以產物和反應物的MALDI-TOF-MS質譜峰峰面積計算標記反應的效率，標記效率（%）= 產物峰面積/（產物峰面積+原肽峰面積）×100%。

3.4 p-SCN-Bn-DOTA與標準肽段偶聯反應的優化

3.4.1 緩沖體系對p-SCN-Bn-DOTA標記反應的影響 考察了3種緩沖體系NaHCO3-Na2CO3體系、DMF-三乙胺體系以及三乙二胺TEAB體系。對于0.5 mol/L NaHCO3-Na2CO3緩沖液（pH 8.8），由于反應產物鹽濃度過高，需要稀釋50倍以上才能被MALDI-TOF檢測到，而且鈉鹽是不可揮發性鹽，Na+對質譜可能產生的干擾不易去除。Scheinberg等[29]將p-SCN-Bn-DOTA與肽段GGGFC在無水的DMF -三乙胺體系中反應，但是實際的生物樣品酶解產物是含水的體系，因此純有機溶劑的DMF-三乙胺體系不適用于生物樣品酶解產物分析。而TEAB是可揮發性碳酸鹽，p-SCN-Bn-DOTA與肽段LGEYGFQNALIVR（m/z 1479）可以在TEAB緩沖體系中反應生成標記產物（m/z 2031），而且結晶狀態好，適合質譜檢測，因此， 選擇TEAB體系進行后續實驗條件優化。

3.4.2 p-SCN-Bn-DOTA的量與肽段量的比例、反應溫度、反應時間對標記反應的影響 由于標記反應中影響標記效率的因素眾多[30，31]，本研究考察了p-SCN-Bn-DOTA量與肽段量的比例、反應溫度、反應時間等因素，結果如表1所示。由表1可見，p-SCN-Bn-DOTA和肽段的摩爾比為32倍，在60℃反應60 min時，標記效率最高，因此選擇上述條件為最佳反應條件。與文獻[20]報道的DOTA-NHS-ester 50倍過量于肽段、肽段的終濃度為0.125 nmol/μL相比，本方法反應試劑的用量少，而且適用的肽段的濃度更低，顯示出更高的標記靈敏度。肽段和標記產物的質譜圖如圖2所示。

3.4.3 反應體系中有機相與水相比例的考察 實驗條件優化過程中，為保證肽段的終濃度一致，需要改變有機相和水相的比例來實現其它參數的調整。實驗過程中發現，在一定范圍內，反應體系中水的比例越高，標記效率越低， 最佳有機相與水相之比為4∶1～5∶1（V/V）。

3.4.4 緩沖體系濃度及pH值對反應的影響 緩沖體系濃度及pH值是影響螯合劑配位能力的主要因素。本研究考察了0.1， 0.2和0.5 mol/L TEAB緩沖溶液在pH值分別為6.5，7.5，8.5，9.5 時DOTA與肽段的偶聯效率，用三乙胺和冰醋酸調節pH值。結果表明，緩沖體系為0.2 mol/L TEAB， pH 8.5的條件下偶聯效率較高，且重現性好。

3.5 p-SCN-Bn-DOTA與RGD肽的偶聯反應

按照2.2.1節實驗方法制備RGD肽，在優化的條件下，即緩沖體系為0.2 mol/L TEAB（pH 8.5），與p-SCN-Bn-DOTA在60℃進行偶聯反應60 min， 實驗結果如圖3所示，標記效率為90.6%。

3.6 反應溫度、反應時間及pH值對螯合反應的影響

對于EuCl3與DOTA 偶聯產物的標記反應，分別考察了乙酸銨-乙酸（HAc-NH4Ac），鹽酸-乙酸鈉（HCl-NaAC）反應體系；反應溫度為30℃，60℃和100℃；反應時間為15和60 min；pH值為4.0和5.5時的標記效率。結果如表3及圖4所示， 其中在pH 4.0 的HCl-NaAC緩沖液中，60℃反應60 min標記效率最高，而且酸性條件下（pH 4.0），可以減少金屬離子和肽段的非特異性結合。

3.7 MALDI檢測方法的考察

對用于MALDI檢測的樣品點樣方法進行了考察，比較了干點法和薄層法兩種方法。如圖5所示，結果顯示干點法相對較好，結晶狀態均勻，樣品檢測靈敏度高。

4 結 論

本研究通過雙功能試劑p-SCN-Bn-DOTA與RGD等標準肽段反應，考察與鑭系金屬元素Eu 螯合效率，對螯合稀土金屬標記肽段的反應條件進行了優化。p-SCN-Bn-DOTA與標準肽段反應的條件為：DOTA 為肽段的32倍，緩沖體系為0.2 mol/L TEAB，pH 8.5，反應溫度60℃，反應時間為60 min； 偶聯產物與金屬離子反應的條件為：pH 4.0的HCl/NaAC緩沖體系中反應60 min。MALDI-TOF檢測時樣品點樣方法使用干點法較好。本研究結果表明， p-SCN-Bn-DOTA在標記RGD等多肽上有良好的應用，有望成為一種新的高靈敏度金屬標記試劑和腫瘤受體顯像劑。

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Abstract A novel labeling approach with good compatibility based on 2-（4-isothiocyanatobenzyl）-1，4，7，10-tetraazacyclododecane-1，4，7，10-tetraacetic acid （p-SCN-Bn-DOTA） was established. The labeling conditions of p-SCN-Bn-DOTA with standard peptides were optimized， and the labeling efficiency of macrocyclic complex of p-SCN-Bn-DOTA with lanthanide metal ion Eu was also investigated. The labeling process was a two-step reaction. The labeling efficiency was affected by several factors including pH， buffer， reaction time， reaction temperature， and ratio of p-SCN-Bn-DOTA to peptide. The optimized conditions were as followed： the first step of labeling reaction was reacted in 0.2 mol/L triethylene diamine （TEAB） （pH 8.5） buffer for 60 min at 60℃， and the molar ratio of p-SCN-Bn-DOTA with peptide was 32. The second step of rare earth metal chelating was in pH 4.0 HCl/NaAC buffer for 60 min at 60℃. This approach was successfully applied in RGD peptide labeling.

Keywords Bifunctional chelating reagents； Labeling； Peptide； Protein quantification； Mass spectrometry